烷基转移酶MGMT与DNA的交联复合物在氮芥细胞毒中的作用

Alkylating agents are usually DNA damage agents. DNA repair enzymes participating in the repair process can be damaged by forming alkylated adducts with the agents. Among the enzymes, O(6)-alkylguanine-DNA alkyltransferase, which can directly remove O(6)-Alkylation adducts, a serious type of DNA damage, is believed to be important because overexpressing of MGMT enhances the cell tolerance to mono-alkylating agents. However, neurol stem cells with proficient MGMT is sensitive bifunctional DNA alkylating agent, nitrogen mustard, which has been used as an antineoplastic and a chemical weapon. The contradictory reports maybe explained by the recent discovery that nitrogen mustard can form DNA-mustard-MGMT (MDC) crosslinking, which was believed to be toxic to cells by repressing DNA replication. To better understand the role of MGMT-DNA crosslinking in the cytotoxic action of nitrogen mustard,we plan to construct oligonucleotide containing MGMT-DNA crosslinking, MGMT-nitrogen mustard complexes, DNA-nitrogen mustard complexes, CHO cells deficient of homologous recombination gene, CHO cells proficient of MGMT and others. Also, GSH, a traditional drug having been approved to be effective in protecting cells from the cytotoxic action of mustard agents,will be employed to see if it can compete with MGMT to form complex with nitrogen mustard. These results would explain the role of MGMT-DNA crosslinking in nitrogen mustard-induced cytotoxic action and provide experimental evidence for new target of bifunctional DNA alkylating agents therapy.

既是抗癌药又是军用毒剂的氮芥是活跃的双功能烷化剂,能诱导生物分子间的交联，造成难愈损伤，但机制不明。烷化剂加合在碱基上是一种常见的DNA损伤方式，O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(MGMT)及时移除加合物能使细胞免受损伤。高表达MGMT的细胞可对单功能烷化剂耐受增加，意外的是此细胞对氮芥的敏感性增加。我们推测氮芥染毒形成的MGMT-氮芥-DNA交联物(MDC)可能既阻止了MGMT修复DNA损伤，又参与了细胞毒性作用。本项目拟以过表达MGMT的CHO细胞为模型，并以固定插入MDC的寡合甘酸链制备、DNA和/或蛋白与氮芥单交联物制备、基因沉默、谷胱甘肽干预、色谱质谱分析等手段，研究氮芥对MGMT过表达CHO细胞的毒性及HPRT基因的突变作用；MDC对DNA复制、转录的影响；MDC形成及修复机制；谷胱甘肽处理对氮芥交联的MDC形成的影响，结果将为揭示氮芥的细胞毒特性，药物使用及开发提供实验依据

氮芥可分别与DNA和MGMT蛋白发生反应，形成了共价稳定的MGMT-DNA交联（mDPC）。我们提出，mDPC不仅干扰了MGMT正常的DNA修复功能，也加重了DNA损伤。主要研究结果如下：.1、人支气管上皮细胞16HBE经氮芥或半硫芥（CEES）、甲醛染毒后，细胞活力下降明显，氮芥引起的细胞损伤较CEES、甲醛等单功能烷化剂强。.2、探索改进DNA定量及DPC检测方法：确定了合适的试剂对细胞内DPC进行简单有效的提取，利用SYBRgreen对双链DNA进行标记并定量，该法简便、定量准确。在此基础上，利用slot blotting对mDPC进行检测；通过FITC标记及荧光强度的测量，对总DPC（total DPC，tDPC）进行检测。探索了ELISA检测mDPC的方法，相对于slot blotting更易普及。.3、氮芥引起包括双链断裂、链间交联、DPC在内的多种形式的DNA损伤，针对DPC，进一步研究了损伤的量效和时效关系。DPC随氮芥浓度升高而增多，DPC形成迅速（1h）、6h略降低，24h重新维持高水平。.4、通过比较不同毒剂染毒对MGMT表达的影响，发现MGMT在氮芥染毒后蛋白及mRNA水平降低，但在与氮芥结构类似的单功能烷化剂CEES染毒后升高，提示两者的损伤机制有差别。.5、进一步探索了MGMT水平对氮芥诱导DPC生成的影响及调控机制，发现维持MGMT的低水平有助于减轻氮芥引起的损伤，c-MYC可通过抑制转录降低MGMT表达、O6BG特异性消耗MGMT以促进降解，两者可减轻MGMT引起的DPC损伤，但O6BG需持续给予，短暂处理易引起反弹。.6、阐明了修复DPC的主要机制包括同源重组及蛋白水解，首次证实蛋白水解修复mDPC，并证实了蛋白水解通路发挥主要作用的酶DVC1。首次证实DVC1有20S蛋白酶体活力，以p97依赖的方式发挥水解MGMT的作用。.7、GSH是已知的巯基供体，对细胞有保护效应。.8、MGMT在染毒后大部分被交联，并被泛素化。首次证实MGMT泛素化的时间依赖性。MGMT通过泛素-蛋白酶体系统降解，首次证实该系统受抑制影响mDPC的清除。.9、构建了过表达MGMT质粒、并研究MGMT的主要功能位点。构建了DVC1过表达质粒，对其进行初步的表观调控研究，发现DVC1受乙酰化调控。为今后的机制研究奠定基础。