DNA修复基因-MGMT甲基化修饰在肿瘤个体化治疗中的作用及机理研究

Glioblastoma multiforme (GMB) resistance to temozolomide, the first-line chemotherapy regimens, is the key issue to be solved in clinical practice. O6-Methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter methylation (CpG 135 and 137) has been shown to be an important biomarker in predicting the GMB patient's responsiveness to temozolomide. However, our recent work and others suggested that MGMT methylation failed to coordinate with patient's outcome，resulting inaccurate prediction of drug sensitivity. We propose that incorrect methylation sites selection might be the major cause of this problem，and the regulatory mechanism study of IDH1 mutation on MGMT methylation will provide some clue on this issue. In this study, we will try to correlate MGMT methylaiton and temozolomide effectiveness by pyrosequencing determination of MGMT gene promoter in GMB samples which was stored in our laboratory and outcome evaluation of temozolomide-treated GMB patient. By investigating the effect of IDH1 mutation on MGMT methylation in cells and analyzing the association of IDH1 mutation and MGMT methylation in clinical patients, the regulatory mechanism of MGMT methyaltion will be revealed in two different levels. This study will play an important role in clarifying the regulatory mechanism of IDH1 mutation on DNA methylation and providing a reliable drug prediction biomarker in cancer treatment.

脑胶质瘤患者对一线化疗药物替莫唑胺的耐药是肿瘤治疗中的一大难题。 DNA甲基转移酶（MGMT）启动子135，137等位点的甲基化修饰与肿瘤耐药相关，是目前预测替莫唑胺疗效的一个重要指标。本实验室及最近的研究发现，MGMT基因135，137位点的甲基化修饰与替莫唑胺疗效相关性不高，导致药物敏感性预测不准确。我们提出甲基化位点的选择错误可能是这一问题的主要原因，而异柠檬酸脱氢酶（IDH1）突变在甲基化修饰中的调控研究可为甲基化位点的选择提供理论依据。本研究拟采用焦磷酸测序扫描已收集的脑胶质瘤病人中MGMT基因全部CpG位点甲基化程度，结合病人用药后疗效，建立替莫唑胺敏感性与甲基化修饰的关系图谱；通过研究IDH1基因突变对细胞甲基化影响和病人IDH1突变- - MGMT甲基化关联分析，从两个层次深入研究甲基化修饰的调控机理。本项目对于阐明IDH1在甲基化修饰中的调控机制和指导肿瘤的治疗有重要意义。

MGMT甲基化修饰是脑胶质患者个性化用药和预后判断的公认的分子标志物，然而由于肿瘤病人对替莫唑胺耐药其临床应用受到一定的限制。其主要原因在于目前对于MGMT甲基化检测存在检测位点的甲基化修饰与替莫唑胺敏感性相关性不高。另外对于MGMT甲基化修饰调控机制以及患者替莫唑胺耐药分子机理的研究无相关报道。本课题采用焦磷酸测序法定量分析了MGMT基因启动子区全部CpG岛甲基化状态，并关联基因表达情况，建立了MGMT甲基化修饰与mRNA表达之间的关系，最终确定了药物敏感性高度相关的甲基化区域并建立了甲基化定量检测方法。在细胞水平上和临床样本两个层次研究IDH1 R132突变对甲基化修饰中的影响，取得的主要成果包括：1. 建立了MGMT启动子区及第一个外显子区共762 bp长度内87个CpG岛甲基化的焦磷酸检测技术，并对42个脑胶质瘤患者组织样本的检测并聚类分析，检测结果将样本聚成了高甲基化组和低甲基化组，其中高甲基化组包括14个脑胶质瘤样本，甲基化范围为30–53%，低甲基化组患者包括28例脑胶质瘤样本，样本甲基化范围为6–25%。2. 检测了样本中MGMT基因mRNA 的相对表达值，并对MGMT基因的甲基化与表达的关联性进行了Mann-Whitney检验，统计学分析显示MGMT基因的甲基化与表达具有极显著地相关性。3. 为了寻找与基因表达最密切相关的甲基化特异的CpG位点，我们将这87个CpG位点分别与MGMT基因的mRNA表达水平进行了Spearman的相关性分析，计算出了这87个位点与基因表达的相关系数r值以及显著性差异p值，根据P<0.01，我们将这些与表达密切相关的位点分为了4个区域：-436 到-374； -342到-249；-228 到-172和 95到153。并分别检测了这四个区域的甲基化与基因表达的相关性，Mann-Whitney检测结果显示这四个区域的甲基化与表达都是密切相关的（p<0.01）；4. 在机制研究方面，我们共检测了40例脑胶质瘤样本的IDH1基因型，检测结果为20例IDH1突变型样本，20例IDH1野生型样本。Mann-Whitney检验分析了IDH1基因型与MGMT基因甲基化以及表达的相关性。IDH1突变型与MGMT基因启动子区域的高甲基化存在着显著地相关性（P=0.017），与MGMT基因的低表达的相关性没有统计学意义（P=0.961）。