底物适应性进化后的Cre酶在Tet-on系统的调控下特异性剔除HIV-1前病毒的研究

剔除整合在宿主基因组上的HIV-1前病毒是彻底治愈艾滋病的关键。Cre酶能特异性识别两个loxP位点并敲除loxP位点间的基因。Cre酶经改组进化后也能识别两个类似loxP的位点并敲除之间基因。HIV-1前病毒两端长末端重复序列上都有类似loxP的位点（loxLTR）。本研究拟用底物适应性改组进化后的Cre酶来识别HIV-1前病毒上的loxLTR，特异性剔除HIV-1前病毒，并用四环素调控系统（Tet-on）控制。经DNA 改组（DNA shuffle）的Cre 酶的基因插入底物适应性的进化载体后，多轮改组、进化、筛选得到的Cre 酶，可以从原来特异性识别loxP位点过渡到能特异性的识别loxLTR。最后，在Tet-on系统的控制下，用进化后的Cre酶来识别HIV-1前病毒两侧的loxLTR序列通过重组特异性的剔除HIV-1前病毒。这将为人类治愈艾滋病提供新的策略。

清除整合在宿主基因组上的HIV-1前病毒是治愈艾滋病的关键。Cre酶能特异性识别loxP 位点，并对两个loxP 位点间序列进行切割或重组。HIV-1前病毒长末端重复序列含有loxP相似位点loxLTR，若将Cre酶进行适应性进化而使其具有识别HIV-1前病毒序列上loxLTR能力，则将使剔除HV-1前病毒成为可能。有研究发现HIV-1毒株TZB0003长末端序列loxLTR与loxP有70％同源性。经多轮改组、进化，我们虽未成功进化出能有效识别loxLTR的Cre进化序列，但结合国外研究，我们成功获取了具有切割loxLTR效能的Cre核酸序列Tre并完成全基因合成。之后构建Tre酶真核表达载体及含loxLTR序列的Tre酶报告载体，并在HeLa细胞中验证了其功能。在慢病毒载体LTR区成功插入LoxLTR序列，并用该假病毒感染细胞，发现该载体假病毒基因组能有效整合到细胞基因组上，这为后续验证Tre酶LoxLTR序列切除功能奠定了基础。进一步在四环素诱导系统pTRE载体中插入Tre序列成功构建pTRE-Tre诱导表达载体，并用四环素调控系统Tet-on控制其表达从而进一步控制识别HIV-1前病毒loxLTR序列的特异性重组功能，这为进一步在体内完成该研究提供了安全保障。以HeLa细胞G418(新霉素)和潮霉素B杀伤浓度测定结果为基础，通过筛选分步将四环素诱导系统中调节载体pTet-On3G和Tre酶表达载体pTRE-Tre序列整合到基因组上，成功建立Tet-on诱导表达Tre酶细胞株。此外，还成功建立了HIV-1病毒储存库的检查方法，并对92例HIV/AIDS患者PBMC中HIV-1 DNA含量进行了检测。总之，本研究使用基因工程方法，合成改组进化后的Cre，构建了其真核表达载体，并对其特异性识别并剪切loxLTR的功能进行了验证。同时使用四环素调控系统Tet-on控制进化后的Cre酶的表达来控制其识别HIV-1假病毒loxLTR序列的特异性重组功能水平，进而控制HIV-1假病毒从宿主基因组中剔除的过程。此外，本研究还建立了检测病毒储存库的方法，为进一步检测进化后Cre酶功能提供研究基础。本研究为清除潜伏感染病毒库中的HIV-1 前病毒提供了有力工具，这不仅为治愈AIDS提供新方法，也为治愈其它慢性病毒感染研究提供了新的研究方向。