嵌合甲基化转移酶在体外靶向沉寂HIV-1前病毒的研究

The important cause of the viral load rebound to the pre-treatment lever after drug discontinuation is the reversibility of the integration of HIV provirus gene silence in HIV latently infected cells. If the latent HIV provirus occurs nonreversible gene silencing by methylation epigenetic modifications in HIV latent cells, there may be induce the long-term virus inactivation as human endogenous retroviruses. To this end, this study intends to design and construct the multiple fusions vectors of nucleic acid enzyme (ZFP or Cas9) and DNA or histone methyltransferase targeting to the HIV provirus according to the conservative region of HIV isoforms gene, and screen the better targeting and active fusion vectors in the cells, respectively; Then, to detect the express levers of HIV provirus and discuss if the methyltransferase fusions can inhibit the expression of integrated HIV provirus by transfecting the methyltransferase fusion vectors into infected and latently infected cells? To detect and analysis the lever and form of methylation on HIV provirus and its nucleosomal histone, to discuss whether the established methylation mode can be communicated by cell division, and to illuminate the mechanism of HIV provirus gene silencing induced by methyltransferase fusions. This study will not only help to reveal the epigenetic mechanisms of regulating HIV latency, but also propose a new thinking for AIDS therapies.

HIV潜伏感染细胞中整合的前病毒其可逆性的基因沉默是艾滋病人停药后病毒载量又会反弹到治疗前水平的重要原因。倘若通过甲基化的表观修饰使HIV潜伏细胞中前病毒发生不可逆性的基因沉默，则有可能同人类内源性逆转录病毒一样导致病毒长期失活。为此，本申请课题拟设计并构建多个靶向HIV前病毒的核酸酶（ZFP或Cas9）与DNA或组蛋白甲基化转移酶的嵌合表达载体，分别在细胞上筛选出具有较好的靶向性以及活性的嵌合体；将筛出的嵌合表达载体转染HIV感染及潜伏感染细胞，检测分析HIV前病毒基因表达水平，探讨嵌合甲基化转移酶对整合HIV前病毒表达是否有抑制作用？检测分析HIV前病毒基因组及其核小体上组蛋白甲基化的水平及类型，探讨新建立的甲基化模式是否可通过每次细胞分裂遗传下去，阐明嵌合甲基化转移酶使HIV前病毒基因沉默的分子机制；本研究将有助于了解HIV潜伏调控的表观遗传学机制，也为艾滋病治愈提出了一个新的思路。

HIV潜伏感染细胞中整合的前病毒其可逆性的基因沉默是艾滋病人停药后病毒载量又会反弹到治疗前水平的重要原因。倘若通过甲基化的表观修饰使HIV潜伏细胞中前病毒发生不可逆性的基因沉默，则有可能同人类内源性逆转录病毒一样导致病毒长期失活。本课题设计并构建多个靶向HIV前病毒的核酸酶与DNA或组蛋白甲基化转移酶的嵌合表达载体，分别在细胞上筛选出具有较好的靶向性以及活性的嵌合体；将筛出的嵌合表达载体转染HIV感染及潜伏感染细胞，检测分析HIV前病毒基因表达水平，探讨嵌合甲基化转移酶对整合HIV前病毒表达是否有抑制作用？检测分析HIV前病毒基因组及其核小体上组蛋白甲基化的水平及类型，探讨新建立的甲基化模式是否可通过每次细胞分裂遗传下去，阐明嵌合甲基化转移酶使HIV前病毒基因沉默的分子机制。. 本课题已圆满完成上述研究内容，发表SCI论文2篇（考核指标SCI文章1篇），专利申请1项（考核指标1项），毕业研究生1人（考核指标1人），已取得如下重要结果： 我们以HIV-1的转录调控区LTR上的保守区为靶点，利用基因编辑技术，构建并筛选出以锌指蛋白为DNA结合域的嵌合甲基转移酶ZF-Dnmt1以及以dCas9/sgRNA为DNA结合域的嵌合甲基转移酶dCas9-Dnmt3a。在HEK-293T和TZM-bl细胞上进行靶点筛选并检测了嵌合蛋白的表达，我们将具有较好靶向性以及活性的嵌合体转染HIV假病毒感染的细胞模型及潜伏感染的细胞模型，结果表明，这些嵌合甲基转移酶能显著抑制前病毒的表达，其作用机制与靶向前病毒LTR转录起始位点两侧的CpG岛甲基化水平增高有关。同时，这种靶向抑制分别能在感染细胞模型和潜伏感染细胞模型上持续15天和40天以上，说明嵌合甲基转移酶造成的前病毒表达抑制能够在细胞代际之间遗传。最后，在Jurkat T细胞中的细胞毒性评估证明了这些嵌合甲基转移酶具有较好的安全性。这些结果支持了DNA甲基化与HIV沉默的相关性，证明了宿主细胞与HIV“和平共处”策略的可能性，为治愈艾滋病提供了一种新思路。