单壁碳纳米管在植物种质资源超低温保存中的线粒体生物学效应研究

Cryopreservation is the best way for long-term preservation of plant germplasm resources, and how to improve plant cryopreservation survival rate is an important scientific issue in the cryobiology field. Our preliminary studies found that adding single-wall carbon nanotubes (SWCNT) to plant vitrification solution (PVS) significantly improved the survival rate in Agapanthus praecox embryogenic callus (EC) cryopreservation, and SWCNTs were mainly concentrated in mitochondria and cell membrane. The SWCNT had a positive role in the regulation of cell respiration under stress. As the most important organelle in EC, the mechanism of interaction between SWCNT and mitochondria function was unknown. This project analyzes the effects of SWCNT on mitochondrial morphology configuration and membrane function at the cytological level. In addition, the effects of SWCNT on the respiratory metabolism pathway during cryopreservation are studied by physiological analysis, qRT-PCR and MRM, and the respiratory enzyme inhibitors are used to determine the action site of SWCNT in the respiratory chain. Further functional verification of mitochondrial in vitro system is used to analyze the regulatory role of CNT on the key stress factors of mitochondrial response. Furthermore, this project establishes the experimental study system to analyze the interaction between SWCNT and its key biological macromolecules including structural characteristics, binding mode, active site and so on. Then the project uses an all-atom model to simulate the interaction between the SWCNT and key protein. This project aims to reveal the biological effects of SWCNT on mitochondrion and the mechanism of SWCNT improving cell survival rate in cryopreservation of Agapanthus praecox EC based on interdisciplinary analyses, and has important scientific significance to promote theory innovation and technological advances in cryopreservation, and lays the foundation for the research of the interdisciplinary field of nanobiology.

申请人前期将单壁碳纳米管(CNT)添加于玻璃化溶液可明显提高百子莲胚性细胞(EC)超低温保存冻后活性，发现CNT进入细胞主要贴膜富集于线粒体，对呼吸代谢具有积极影响，线粒体作为EC中最为重要的细胞器，但CNT对其功能的调控机制尚不清楚。本项目拟基于CNT超低温保存逆境保护生物学效应模型，在细胞结构学层面分析CNT对线粒体形态与膜功能的影响，评价逆境下CNT与线粒体结构的互作效应；在生理、基因与蛋白层面研究CNT对呼吸代谢途径的影响，并采用呼吸酶抑制剂确定CNT在呼吸链的作用位点；利用线粒体体外系统进一步功能验证，分析CNT对线粒体响应关键胁迫因子的调控作用；建立CNT与其调控的关键线粒体相关生物大分子互作的研究体系，使用分子动力学模拟CNT与其作用蛋白之间的结构动力基础。利用多学科研究手段揭示CNT在改善超低温保存效率过程中的线粒体生物学效应，为纳米材料在超低温保存领域的应用提供理论依据。

为了探究单壁碳纳米管对植物线粒体功能及相关代谢的调控机制，本项目运用多学科分析手段，建立了单壁碳纳米管细胞抗逆保护作用生物计量效应模型，明确了单壁碳纳米管处理对线粒体形态结构的影响，分析了单壁碳纳米管对超低温保存过程中百子莲胚性愈伤组织呼吸代谢途径的调控作用，探明了单壁碳纳米管与线粒体关键蛋白互作方式。进一步丰富了超低温保存的外源物质效应理论，为拓展植物种质资源高效保存新技术提供依据，为发展纳米生物学交叉领域研究奠定理论基础。.利用植物超低温保存模式体系确定单壁碳纳米管最佳浓度，并应用于多个物种不同类型的离体材料中，均证实添加0.1g/L单壁碳纳米管是玻璃化法超低温保存的最佳方案，对该模型的胁迫响应进行分析，关键胁迫生理指标均有不同程度的降低，而保护酶活性有所升高。添加单壁碳纳米管的超低温保存各阶段的细胞结构更为完整。单壁碳纳米管的添加会抑制线粒体呼吸作用，降低线粒体呼吸产生的ATP速率和线粒体电子传递链复合物活性。结合基因和蛋白层面的分析结果，线粒体电子传递链复合物Ⅲ可能是单壁碳纳米管在线粒体呼吸链上的潜在作用位点。复合物Ⅲ结合了单壁碳纳米管后，其蛋白二级结构变化最明显的是α-Helix结构减少，蛋白分子结构稳定性降低，这些变化可能会导致其作为呼吸链关键蛋白功能丧失。蛋白构象变化研究发现单壁碳纳米管与复合物Ⅲ蛋白结合更加紧密，单壁碳纳米管占据着复合物Ⅲ蛋白上与复合物Ⅳ结合的位点，竞争性的抑制其形成超级复合物，阻止其呼吸链的电子传递，使细胞无法完成呼吸作用，降低了线粒体ATP产生的速率。综合本项目研究结果，添加单壁碳纳米管可提高玻璃化法超低温保存的效率，并对线粒体呼吸作用有一定的抑制作用，通过改变线粒体电子传递链复合物Ⅲ的蛋白结构，占据其它关键蛋白的结合位点，以降低线粒体ATP产生的速率，使投入液氮前的细胞保持较低的能量代谢水平，以抵御后续的冻融胁迫带来的严重伤害，最终保持了冻后细胞较高的活性。