链霉菌中一种新的聚氨基酸-γ-聚二氨基丁酸的合成机理与生理功能

从一株ε-聚赖氨酸（ε-PL）生产菌株小白链霉菌（Steptomyces albulus）PD-1中发现该菌能同时产生另一种聚氨基酸-γ-聚二氨基丁酸(γ-PDBA)，这是一种从未报道的新聚合物，是一种潜在的生物防腐剂。本项目拟研究这一全新聚氨基酸的合成机理和生理功能，纯化聚合关键酶-聚二氨基丁酸合成酶（PDBs），考察其酶学性质；从纯酶核苷酸片段的序列信息入手，钓取完整pdbs基因序列，进而进行该基因的表达验证。将其与ε-PL合成酶基因进行蛋白序列比对分析，对PDBs 中各个结构域进行研究，探讨PDBs合成机理；采用同源双交换技术敲除pdbs基因，获得PDBs缺失突变株，比较突变体的生理变化，解释γ-PDBA的生理功能。本研究的预期结果能够较系统地阐明链霉菌合成γ-PDBA这一全新聚氨基酸的机理和方式，也有助于更好地理解并指导ε-PL与γ-PDBA合成和调控，学术意义和应用价值重大。

本项目以ε-聚赖氨酸(ε-PL)生产菌株Steptomyces albulus PD-1为研究对象，取发酵液经过多步分离纯化及分析鉴定，得到自然界第四种天然聚氨基酸：聚二氨基丙酸（PDAP）。抑菌实验证实PDAP对大部分的细菌、真菌都具有较好的抑菌性，对酵母的抑菌效果尤为突出，抑菌谱和ε-PL互补。之后对S. albulus PD-1进行全基因组测序，通过基因组信息挖掘、目的基因预测、假定基因敲除及异源表达、体外酶催化等试验确定了负责PDAP合成的三个关键酶：丝氨酸脱水酶NjxA和鸟氨酸环化酶NjxB负责二氨基丙酸单体（L-DAP）的合成，合成的L-DAP经过一种非常规的非核糖体合成酶（NRPS）组装形成PDAP。对PDAP合成酶的结构域进行生物信息学分析，发现它包含一个经典的NRPS腺苷酰化结构域（A domain）和氨基载体蛋白结构域（PCP domain），但是与传统的NRPS结构不同的是，PDAPs的C-端有一个未知功能的终止结构域，该结构域大小（含779个氨基酸）约为普通NRPS的3倍，此种特殊的NRPS结构报道过ε-PL合成酶（PLs）一例。PDAPs和PLs合成酶结构的相似性使得我们猜测这种结构为此类聚氨基酸合成酶的共有特征，为以后新型聚氨基酸的人工设计及自然挖掘提供了强有力的证据。之后项目组研究了pH、溶氧、发酵液中有机酸等因素对ε-PL 和PDAP共生的影响，并且通过测定ε-PL和PDAP浓度、菌体干重、葡萄糖消耗速率、关键节点处酶活、细胞内还原力NADP+/NADPH等指标，确定ε-PL和PDAP共生的代谢途径各节点物质流和能量流分配关系。此外，课题组针对ε-PL和PDAP发酵过程中原料价格太高的问题。使用水解糖蜜和菌体水解液作为ε-PL和PDAP发酵原料。在1吨发酵罐上进行补料分批发酵证实该工艺可以节约30.6%的原料成本，为实现绿色环保、经济有效的ε-PL和PDAP生产打下了良好的基础。本项目共获得包括国家技术发明二等奖在内的奖励4项，发表论文16篇，其中影响因子>4的SCI论文5篇，授权专利7项。