基于降解酶调控解析与设计的聚谷氨酸分子量多元化合成研究

Controllable synthesis of biopolymer molecular weight has always been a subject of great concern to the scientific community and industry. γ-polyglutamic acid (γ-PGA) is a representative microbial synthetic polymer, and the market has shown strong demand for various molecular weight products in recent years, but few studies have been done. In this study, the controllable synthesis of γ-PGA multivariate molecular weight was the target. In the bacterium Bacillus amyloliquefaciens NX-2S, this study intends to use transcriptomics, gene knockout / back-up and other techniques to determine the key regulator of gamma-PGA-degrading enzyme replenishment, and clarify the effect of regulation factor expression intensity on the activity of γ-PGA degrading enzyme and the molecular weight of hydrolyzate, also to obtain the corresponding relationship between the ratio of γ-PGA D / L configuration and the molecular weight of the hydrolyzate. On this basis, using fermentation engineering, synergistic degradation enzyme regulation and product D / L configuration regulation means, this study aims to achieve efficient preparation of three different molecular weight γ-PGA. Degrading enzyme is a ubiquitous key element in biopolymer synthesis, the results of this study will enrich the understanding of biopolymer degradation mechanism, and provide a useful reference for the study of molecular weight regulation of other similar biopolymers.

生物高分子的分子量可控合成一直是科技界和工业界极为关注的课题。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一种有代表性的微生物合成高分子，近年来市场对其不同分子量的产品呈现出了旺盛的需求，但研究极少。本项目以γ-PGA多元分子量的可控合成为目标，在其产生菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S中，拟采用转录组学、基因敲除/回补等技术确定启动γ-PGA降解酶表达的关键调控因子，阐明调控因子表达强度对γ-PGA降解酶活力及水解产物分子量的影响规律，获得γ-PGA D/L构型比例与水解产物分子量的对应关系。在此基础上采用发酵工程手段，协同降解酶调控和产物D/L构型调节手段，实现三种不同分子量γ-PGA的高效制备。降解酶是生物高分子合成中普遍存在的关键元件，本研究结果将丰富对生物高分子降解机制的认知，同时为其它类似生物高分子的分子量调控研究提供有益借鉴。

生物高分子的分子量可控合成一直是科技界和工业界极为关注的课题。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一种有代表性的微生物合成高分子，近年来市场对其不同分子量的产品呈现出了旺盛的需求，但研究极少。本项目以γ-PGA多元分子量的可控合成为目标，以一株自主筛选获得的γ-PGA生产菌B. amyloliquefaciens NBCSO为研究对象，采用模块化代谢通路改造策略，提升菌株的γ-PGA合成效率。同时，引入适配性优化的γ-PGA降解酶表达元件，解析了γ-PGA降解酶表达水平与γ-PGA分子量之间对应规律。在此基础上，利用CRISPRi系统实现对降解酶的理性表达调控，首次构建出一菌合成多种分子量γ-PGA的微生物生产模式，实现了一菌直接合成高（>800 kDa）、中（400-600 kDa）、低（50-100 kDa）不同分子量γ-PGA，其产量达到25-27 g/L。此外，进一步耦合调控γ-PGA立体化学构型与γ-PGA降解过程，拓宽了γ-PGA分子量分布范围，对解决γ-PGA在不同领域的不同应用需求具有重要的意义。最后，为提高底物原料利用转化效率，开发了菊芋高值化制备γ-PGA的绿色生产工艺。以菊芋果渣水解液用于γ-PGA的大量合成，最终在连续补料下γ-PGA浓度最高达到35.32 ± 0.38 g/L，分子量维持在20-30 kDa。本项目成果丰富对生物高分子降解机制的认知，同时为其它类似生物高分子的分子量调控研究提供有益借鉴。