活细胞线粒体比例荧光超分辨成像研究

With the rapid development of life science, superresolution imaging microscopy has implicated tremendous potential in the field of biological medical imaging. However, there are still some shortcomings to be solved for superresolution imaging microscopy in biological imaging applications, e.g. difficulty in live cell imaging, quantitative information acquisition and tracking of dynamic processes etc. In view of above considerations, a new ratio-fluorescence based superresolution imaging method is herein developed and suitable fluorescent probes will be synthesized; in the meanwhile, the optimization of imaging system and update of the analysis software will be also done to enable the implementation of the superresolution ratio imaging. Furthermore, the ideal candidates are required to target mitochondria by specifically labeling proteins on the Inner or outer mitochondrial membrane (e.g. ANT or VDAC). The new method will facilitate the acquisition of quantitative information about mitochondria in living cells, such as distributions and interactions of mitochondrial membrane proteins, mobility of membrane, fission-fusion dynamics and mitochondrial tubulations, etc. This will help to study the mitochondria related diseases with quantitative information from suborganelle, even single molecular levels. It can be approved as a promising tool for the implementation of Precision Medicine Initiative and promotion of further development of biomedical science, which has not been reported before.

随着生命科学的快速发展，超分辨显微成像技术在生物医学成像领域表现出极大的应用与发展潜力，然而，超分辨成像在应用上还存在活细胞成像、定量信息获取及过程动态研究困难等问题。申请人拟发展一种基于比例荧光型的超分辨成像方法，设计适合于该方法的新型比例荧光探针，优化超分辨成像系统及升级重构软件，实现活细胞的超分辨比例成像及特定目标或动态过程的定量信息获取；将优化后的新型比例荧光探针用于特异性共价标记线粒体内、外膜蛋白质（腺嘌呤核苷转位酶与电压依赖阴离子通道蛋白），实现标记线粒体及其内外膜，利用比例荧光的超分辨成像方法对线粒体膜及蛋白质进行高分辨成像。通过重构软件，可以获取线粒体膜蛋白质相互作用、线粒体融合-分裂、网管化等动态过程的定量信息，研究其生物学功能。该成像方法的应用可从亚细胞甚至分子层面为线粒体相关疾病的发病机制研究提供定量信息，为精准医疗提供新的工具，推动生物医学深入发展，未见文献报道。

生命科学的快速发展要求从亚细胞甚至更小结构层面研究疾病的发生、发展机理。传统光学技术受到衍射极限限制，无法获得高清晰结构，电子显微镜受样品限制，无法满足活细胞的动态成像需求。既能实现衍射极限之下结构又能进行动态成像的新型光学成像技术尤为重要。超分辨成像技术尤其是STORM，STED及SIM为代表的超分辨技术的应用越来越广泛。荧光成像探针作为超分辨成像的重要组成部分，探针性能决定超分辨成像结果效果。本项目根据STORM，STED成像的不足，开展了一系列研究，开发了满足条件的超分辨成像探针。对于STORM超分辨成像，开发了不需要外加氧化还原体系的线粒体选择性标记STORM探针，在低功率激光照射下实现光致闪烁，通过主成分分析、K因子等算法降低噪声进行结构重构，实现45 nm的活细胞成像分辨率，同时通过优化实验条件和图像重构算法，获得线粒体的动态过程的超分辨成像，时间分辨率0.8s，显著提高STORM超分辨成像的时间分辨率。并将该技术用于动态追踪线粒体微管的纳米级的动态变化，并对其运动速度进行了定量分析及线粒体膜上蛋白质的分类研究。另外，设计合成新型方酸菁染料探针，具有超低的饱和损耗激光功率，实现35 nm的活细胞STED超分辨成像，长时程成像了线粒体动态分裂与融合过程中线粒体内膜宽度的定量变化，为线粒体相关的生理与病理研究提供了有用工具，此外，开发了新型绿色荧光探针实现了线粒体自噬过程的成像研究。提出了一种基于虚拟单像素结构光超分辨成像，相比传统结构光超分辨成像技术，显著减少了图像重构所需要的帧数，提高了时间分辨率，为活细胞的超分辨成像提供了新技术。在近红外成像方面，开发了不同的聚集诱导发光纳米颗粒，分别进行了小鼠的前哨淋巴结成像，深层血管与肿瘤组织成像，以及小鼠肿瘤的低功率光力学治疗研究。使用谱域光学相干层析成像技术，分别实现手机屏幕内部缺陷的定量表征与形成机制研究，对人体、小鼠皮肤癌进行了结构表征与动力学研究，为此类特征的结构研究提供了新的研究方法。