活细胞（组织）线粒体微环境粘度可视化双光子比例荧光染料

Mitochondrial dysfunction caused by abnormal microviscosity in mitochondia of cells andtissues was reported to be associated with the pathogenesis of human serious diseases. The repoted non-mitochondria-targeted viscosity-sensitive fluorescent probe with short absorption and emission wavelength can't be used for the measurement of microviscosity in mitochondria becaused of the interference of proteins containing porphyrin in mitochondria and the concentration of probe. We proposed to solve all these problems with new two-photon, mitochondria-targeted viscosity-sensitive two-photon ratio fluorescent probes. Base on our newly-synthesized viscosity-sensitive ratio fluorescent dye RY-4 which bear dicyanovinyl as rotating group, show two-photon excitation (800nm), in the present project, we will investigate the selectivity of fluorescent probe to mitochondria by modulating the hydrophobicity, hydrophility or charge distribution of the probe, and for the first time to obtain new two-photon ratio fluorescent probes for the measurement and imaging of microviscosity in mitochondria of cells and tissues under different pathological state. Upon the completion of our project, the new probes will be useful and important for investigating the viscosity change in mitochondria, related pathogenic mechanism and early diagnosis of many serious diseases.

细胞线粒体微环境粘度异常致其功能紊乱与多种人类重大疾病密切相关。现有的活细胞荧光粘度探针存在无线粒体靶向性；激发和发射波长短，受到线粒体中含卟啉蛋白吸收和发射的干扰；受探针浓度等影响不能实现粘度定量荧光成像三大不足。为此提出用线粒体靶向、长波长激发与发射的双光子比例荧光探针解决所有问题。我们拟合成含二氰基乙烯基作为转子基团的RY-4系列荧光染料，用近红外双光子激发(800nm)、长波长比例荧光（665nm/565nm）对粘度响应；拟通过调整该探针的亲水/亲油及整体电荷性质，研究分子结构（取代基类型、位置等）对探针在线粒体的选择性，获得靶向对活细胞（组织）线粒体微环境粘度敏感的双光子比例荧光探针，实现对不同病理细胞（组织）线粒体微环境粘度变化快速、灵敏响应和可视化, 这类工作未见报道，将对研究细胞（组织）线粒体微环境粘度变化规律和相关疾病的病理、及诊断应用具有重要意义。

细胞线粒体微环境（粘度、极性等）及分子或离子浓度异常致其功能紊乱与多种人类重大疾病密切相关。现有的活细胞荧光探针存在缺乏无线粒体靶向性；激发和发射波长短，受到线粒体中含卟啉蛋白吸收和发射的干扰；受探针浓度等影响不能实现靶向线粒体微环境及其分子或离子定量荧光成像三大不足。为此在本项目执行过程中，为了解决以上问题，我们设计、合成了一系列新的近红外激发发射的，靶向对线粒体微环境及其分子或离子响应的单波长或比例荧光探针，具体成果为: （1）基于扭曲BODIPY结构的活细胞微环境粘度成像荧光染料探针BV-1, 为基于BODIPY分子中空间位阻设计粘度及其它分子响应的荧光探针提供了新思路；（2）首次构建了可靶向对活细胞线粒体中氟阴离子识别的荧光分子(FP)，对氟阴离子选择性高，不受其他体内阴离子如AcO-, H2PO4-, HCO3-, Cl-, Br-, and I- 干扰；（3）设计并合成了一种新的基于ICT机理的以香豆素为发光母体的对溶液极性响应的比例荧光探针BOB，发现BOB能靶向对活细胞线粒微环境溶液的极性进行检测和可视化，利用BOB首次发现癌症细胞线粒体微环境的极性也比正常细胞的低；（4）设计并合成了一种新的可以检测活细胞线粒体内SO32-/HSO3-的荧光染料CY-SO2，发现该染料探针可以对目标在90s内快速响应，且不受生物体系内其他相关分子的干扰。CY-SO2的I467/I580比值也不受溶液pH变化的影响且CY-SO2稳定性很好，CY-SO2可以靶向对线粒体内的HSO3-进行检测和可视化；（5）利用Michael addition反应获得新的识别次氯酸的荧光染料探针 BClO，该探针可以快速响应HClO(1s),且具有目前报道的最高的灵敏度，检测限为0.56nM，首次实现对癌细胞本底的次氯酸进行定量和可视化；（6）首次基于普鲁兰糖构建了一种癌细胞微环境特异性响应的光敏剂纳米胶束P-s-s-PpIX，实现了癌细胞还原环境激活的肿瘤识别及光动力治疗，大大降低了光敏剂对正常细胞的损伤。所有以上的成果将对研究细胞（组织）线粒体微环境（粘度、极性等）及分子或离子浓度变化规律和相关疾病的病理、及诊断应用具有重要意义。