中华绒螯蟹高不饱和脂肪酸合成能力的评估及其营养调控

The highly unsaturated fatty acids(HUFA) is close related to growth, development, reproduction and quality in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis. Aimed at the key problems on assess ability of HUFA synthesis and mechanism of nutritional regulation in Chinese mitten crab, some gene of HUFA synthesis will be cloned by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends(RACE) and be identified profile expression of tissue and development stage. Functional characterization of cDANs by heperologous expression in the yeast will be confirmed. The changes of HUFA synthesis under dietary different lipid levels, ratio of fish oil/ pant oil will be explored. Moreover, according to the changes of fatty acid metabolism related enzymes, hormone, and transcriptional factor, the regulation mechanism of HUFA synthesis under nutritional factors will be analyzed. Through this project, function gene related to HUFA synthesis will be build, and the regulation mechanism of HUFA synthesis under different nutritional factor will be revealed, especially the molecular regulation mechanism. This study will provide large amount of information about improving nutritional quality and also be as a theoretical basis for other oil instead of fish oil in diet in crustaceans.

高度不饱和脂肪酸（HUFA）与中华绒螯蟹的生长、发育、繁殖和食用品质等关系密切，但是蟹类HUFA生物合成途径及其营养调控的研究非常滞后。因此，本项目拟采用RT-PCR 和RACE 相结合的方法克隆中华绒螯蟹HUFA合成所需的相关基因；荧光实时定量PCR、原位杂交的方法测定这些基因组织特异性表达和发育阶段特异性表达；采用酵母表达系统评估中华绒螯蟹HUFA转化效率及合成能力。在此基础上，通过在体和离体实验，探讨不同脂肪酸、不同油脂配比等营养调控方式对中华绒螯蟹HUFA合成能力的影响，并从脂肪代谢相关酶表达和活性、激素、转录因子等方面探讨调控的初步机制。通过以上研究，阐明中华绒螯蟹HUFA合成途径并评估其HUFA合成能力，揭示高度不饱和脂肪酸合成能力与饲料中脂肪酸种类、油脂配比的相关性，为通过营养调控方式提高中华绒螯蟹的营养品质，以及甲壳动物饲料配比中鱼油的取代提供理论基础。

高度不饱和脂肪酸(HUFA)是中华绒螯蟹的重要脂肪酸，在中华绒螯蟹繁殖、成活、生长和蜕壳等众多方面都起着无法代替的作用，其在肝胰腺、肌肉等可食部分的含量是决定中华绒螯蟹食用品质的重要指标。在硬骨鱼类中已获得了一系列HUFA 合成酶的基因信息，但是蟹类HUFA 生物合成途径及其营养调控的研究非常滞后。本项目采用RT-PCR 和RACE 相结合的方法克隆获得中华绒螯蟹HUFA合成所需的脂肪酸去饱和酶基因FAD6b、FAD9、脂肪酸延长酶ELOVL6、ELOVLm等相关基因，荧光实时定量PCR方法测定这些基因的组织特异性表达和发育阶段特异性表达。成功构建了原核表达载体pCold-fad9和pCold-fad6b，将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达，用亲和层析柱技术对表达产物进行纯化，并进行Western-bloting验证，通过气相色谱-质谱联用对重组菌BL21/ pCold-fad9和BL21/ pCold-fad6b的代谢产物进行了定性分析。成功构建了中华绒螯蟹FAD9和FAD6b脂肪酸去饱和酶基因的酵母表达系统，通过测定转化酵母菌中脂肪酸含量评估所获得相关基因脂肪酸去饱和能力；成功构建中华绒螯蟹脂肪酸碳链延长酶基因的酵母表达系统，通过测定转化酵母菌中脂肪酸含量评估所获得相关基因脂肪酸碳链延长的能力。通过在体和离体实验，探讨不同脂肪源、不同油脂配比等营养调控方式对中华绒螯脂肪酸去饱和酶及脂肪酸延长酶等基因表达的影响，以及对相关转录组和蛋白组的影响。以上研究表明，中华绒螯蟹具有一定的HUFA 合成能力，不同脂肪酸和不同油脂配比等营养调控对中华绒螯蟹HUFA的合成能力均有显著的影响。研究结果为进一步改良中华绒螯蟹饲料脂类成分以调控其HUFA 的合成，提高中华绒螯蟹配合饲料中植物油替代鱼油的比例，提高其营养品质和经济效益奠定了基础，对于指导中华绒螯蟹配合饲料中脂肪源的选择和必需脂肪酸的添加等具有重要的实际意义，该研究为进一步确保中华绒螯蟹养殖的持续和健康发展提供了保障。