基于活细胞超分辨成像研究视网膜色素变性的感光细胞线粒体超微变化

Retinitis pigmentosa (RP) is a kind of common hereditary disease with unknown pathogenesis and is difficult to be cured clinically, characterized by progressive rod photoreceptor cell death. Mitochondria, abundant in photoreceptor inner segment, specifically exercise the metabolic function and also participate in some part of molecular mechanisms of progressive photoreceptor cell death. Therefore, we hypothesized that morphology change of mitochondria may occur before photoreceptor cell death or actuate photoreceptor cell death in RP patients. In the present clinical and basic research, the resolution of the optical microscope limits the morphological study of mitochondria in living photoreceptor cells. Super-resolution imaging is a cutting-edge optical imaging technology provided with nanoscale spatial resolution for sub-cellular organelles in living cells. The applicant developed a strategy using cell-permeable fluorescent probe to achieve nanoscale organelles super-resolution imaging in living cells, which has been published in top journal of Nature Communications. This project intends to introduce super-resolution imaging technology into living photoreceptors and design a cell-permeable photo-switchable fluorescent probe for mitochondria specific labeling followed by live-cell super-resolution image of mitochondria in stem cells-derived photoreceptors in mitochondrial-related RP patients. This project will be the first use of super-resolution imaging technology to achieve nanoscale mitochondria imaging in living photoreceptor cells, and the morphological research of mitochondria will bring up new enlightenment for RP disease.

视网膜色素变性（RP）是机理不清且难以治疗的常见遗传性眼病，特征是感光细胞的程序性死亡。线粒体是感光细胞的“能量发动机”，大量证据表明线粒体对感光细胞凋亡及调控起着十分关键的作用。因此，我们提出假设：在RP患者的感光细胞中，线粒体的改变先于或促动感光细胞的凋亡。然而，目前研究所用的光学成像系统分辨率无法达到活细胞水平对线粒体进行细微观察。近年来发展的超分辨成像能够对活细胞进行纳米级成像。申请人曾原创性发展了透膜靶向荧光标记策略，结合超分辨技术实现了活细胞内细胞器的纳米级成像（Nat.Commun.一作）。本项目拟针对线粒体相关RP患者干细胞分化来源的感光细胞，设计透膜靶向线粒体荧光探针，采用超分辨成像技术实现活细胞内线粒体超微成像，观察感光细胞分化成熟后线粒体的形态及动态变化特征。本项目将是首次利用超分辨成像技术实现活感光细胞中纳米级线粒体成像，将为RP中感光细胞凋亡研究带来新的科学依据。

感光细胞是哺乳动物体内耗氧量最大的细胞类型之一。线粒体是感光细胞内负责能量代谢的重要细胞器，而线粒体的形态在视网膜疾病状态下发生了巨大变化。本项目“基于活细胞超分辨成像研究视网膜色素变性的感光细胞线粒体超微变化”以视网膜感光细胞内的线粒体为研究目标，重点研究视网膜色素变性（RP）疾病过程中感光细胞线粒体的变化情况，通过超高分辨成像的方式实现线粒体结构的超微检测。.本项目在前期研究基础上，发展了一种新型的化学小分子探针。此探针在离体检测时能够标记线粒体。然而探针在组织层面的标记效果不佳。为此，本研究将研究对象拓展到视网膜色素上皮细胞（RPE），发现在胚胎干细胞分化RPE的分化过程中，传代培养极大地影响了RPE中线粒体的耗氧情况，导致RPE的生存潜能在第四代时达到最高。这一结果为细胞移植提供了理论基础，指导着找到最合适的移植细胞源。.另一方面，本研究在基于项目设定的干细胞分化视网膜类器官方面完成了大量拓展。本项目将荧光蛋白引入到感光细胞前体细胞标志物CRX基因上，从而发展了新的干细胞系。此细胞系能够成功标记感光细胞前体细胞及成熟的感光细胞。我们基于此细胞系的分化，发现CRX单个等位基因的敲除阻止感光细胞的成熟过程，并在早期表现出前体细胞的受限制的运动特征。现有的文献几乎没有报道过前体细胞的运动，本研究采用的成像方法则补充了这一部分的研究方向。.除此之外，本研究聚焦到电场对感光细胞生长的影响。本研究通过一个简单的装置，将永生化的感光细胞661W置入电场中，并最终发现细胞增殖在一定电场强度范围内被促进，电场过强则会促进细胞凋亡。.本项目还尝试着采用超高分辨自适应光学的方法检测人视网膜中视锥细胞的密度。结果显示，黄斑周围的视锥细胞密度在RP病人中表现出明显的下降，且在距离黄斑中心0.4-0.6mm范围内下降得最为明显。这一结果丰富了RP疾病的认知，可能为临床上的早期干预提供依据。