新型载双自杀基因靶向微泡在肝癌治疗中的作用及其机制研究

As a safe gene therapy vector, microbubble contrast agent can be effective for targeted gene transfection under ultrasonic irradiation, and becomes the research hotspot in the current tumor gene therapy field. However, the gene transfection efficiency can not achieve the desired height because of the inefficient combining ability of the gene contained targeted microbubbles, and it becomes a bottleneck restricting the further application of this technology.Our current project aims to improve the targeted binding ability of the microbubbles as the starting point, observing the combination stability and security of the new integrin αVβ3 targeted microbubbles in vitro and the effect of targeted liver cancer therapy in vivo; At the same time, gene transfection, immunohistochemistry, RT-PCR and Western blot will be used to clarify the mechanism of KDR promoter-driven CD/TK fusion gene (KDRP-CD/TK) on the proliferationcapacity and induction of apoptosis mediated by integrin αVβ3 targeted microbubbles, providing the experimental basis and exploring new ideas for the targeted liver cancer therapy by novel gene carried microbubbles.

微泡造影剂作为基因治疗中一种安全的载体，在超声辐照下能够有效的进行靶向性基因转染，成为当前肿瘤基因治疗领域的研究热点。目前，载基因靶向微泡存在微泡的靶向结合效率不高的缺陷，致使基因转染率不能达到理想的高度，成为制约该项技术进一步应用的瓶颈。本项目以改进微泡的靶向结合力为切入点，通过体外实验观察新型整合素αVβ3靶向微泡造影剂的靶向结合稳定性和安全性，通过体内实验观察肝癌靶向治疗的效果；同时运用基因转染、免疫组化、RT-PCR和Western blot等方法阐明整合素αVβ3靶向微泡介导KDR启动子驱动的CD/TK融合基因（KDRP-CD/TK）对肝癌细胞增殖能力和诱导凋亡的作用机制，为新型载基因微泡的肝癌靶向治疗提供实验依据和开拓新的思路。

原发性肝癌，大多来源于肝硬化及肝炎，是较常见的肝癌类型。本课题组成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP）和 KDR启动子的双自杀基因质粒载体 pEGFP-KDRP-CD/TK，研究证实双自杀基因对肿瘤的抑瘤效果明显优于 CD 或 TK 基因的效果。超声微泡造影剂携带基因治疗肿瘤是当前的研究热点，为肿瘤治疗带来了新的希望。本研究旨在以肿瘤组织中的整合素αvβ3为靶点，抗αvβ3抗体为配体，通过生物素-亲和素-生物素桥接方法将抗αvβ3抗体连于具有亲和素连接位点的阳离子靶向微泡 (cationic microbubbles, CMBs)上，制备出一种新型超声靶向治疗微泡CMBsαvβ3；研究证实αvβ3及质粒与新型靶向微泡表面的结合效率远高于阳离子微泡CMBs，且在相同条件下转染效率较CMBs也有显著的统计学意义；而αvβ3阻断抗体预处理显著降低了新型CMBsαvβ3微泡与上述两种细胞系的附着结合，这提示CMBsαvβ3-HepG2细胞的结合具有肝癌组织特异性，且由αvβ3整合素介导。本课题组运用免疫荧光、PCR和免疫印迹三种手段从RNA和蛋白质水平检测了CD/TK在肝癌细胞中的转染情况，数据显示新型微泡组的转染率较普通阳离子微泡组具有显著统计学意义。此外，新型靶向微泡CMBsαvβ3在加入前药5-FC/GCV后能明显促进诱导细胞周期阻滞在S期。在超声辐照下加入前药5 - FC / GCV与靶向微泡CMBsαvβ3结合可明显诱导细胞凋亡；为了探究整合素αVβ3 靶向微泡介导 pEGFP-KDRP- CD/TK 系统对在体肝癌组织的杀伤作用，本课题运用HepG2肝癌移植瘤模型进行实验，经研究发现超声辐照CMBαVβ3 +CD/TK双自杀基因+5-FC/GCV组对肝癌皮下移植瘤的体积有较为满意的体内抑瘤效果。新型抗αvβ3整合素阳离子靶向超声微泡，能携载双自杀基因并在体内外实现较高效率的基因转染，对肝脏肿瘤以及其他肿瘤疾病的有着较高的临床应用前景。