漆酶在新型隐球酵母中调控相关蛋白的研究

漆酶在真菌中普遍存在，广泛应用于工业与环境等领域。然而对真菌中漆酶调控的分子机制了解较少。新型隐球酵母表达较高的漆酶活性，作用多酚类底物产生黑色素，方便定性与定量分析；完成三个菌株的全基因组测序为分子水平的诠释奠定基础，是较好的研究模型。漆酶应对环境压力存在紧密复杂的调控，针对某一蛋白具有时间与空间的局限性，因此构建蛋白质相互作用关系网络是更为有效的途径。本课题在原有酵母双杂交系统的基础上进行改造。构建可发生同源重组的受体菌株，实现相互作用蛋白编码基因的物理结合，经分子生物学处理，结合高通量测序技术在基因组范围内进行高效的大规模筛分，称为BI-Tags（binary interaction Tags yeast two hybrid system），在覆盖率以及数据分析方面均有较大的优势。应用该技术构建不同压力条件新型隐球酵母蛋白相互作用网，完善漆酶在新型隐球酵母中调控的分子机制。

新型隐球酵母（Cryptococcs neoformans）属担子菌，是临床上常见的病原真菌，主要引起免疫缺陷患者脑炎。大量的文献报告表明，新型隐球酵母主要毒性致病因子包括高温生长能力、多糖荚膜（capsule）和含铜多酚氧化酶漆酶（laccase）。本项目应用改造的酵母双杂交系统BI-Tags（binary interaction Tags yeast two hybrid system）在基因组范围内进行高效的筛分，构建新型隐球酵母蛋白相互作用网，进一步完善漆酶在新型隐球酵母中的调控机制。利用传统酵母双杂交系统和BI-Tags两种方法筛选与铜应答转录因子cuf1相互作用的蛋白，在发现了具有相互作用蛋白的同时，也验证了BI-Tags技术的可行性。在此基础上，构建DNA结合结构域融合蛋白cDNA文库，实行双文库杂交筛选。通过筛选得到了198个阳性克隆，分别编码21个诱饵蛋白和57个猎物蛋白，形成64对具有相互作用的蛋白对。这些蛋白涉及到了生物体基本代谢途径中的糖代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢等基础生物新陈代谢途径的相关蛋白，并与致病因子紧密联系。丰富了新型隐球酵母蛋白质相互作用网络，完善了新型隐球酵母致病因子的蛋白调控机制，为以后更一步的研究奠定基础。同时，在此基础上构建不同压力条件下正常野生菌株和△cuf1 缺失菌株的BI-Tags cDNA文库，为进一步研究压力条件下△cuf1 缺失菌株和正常菌株之间蛋白表达差异奠定基础。