隐球酵母中抑制漆酶表达的葡萄糖信号通路新成员的发现及功能研究

新型隐球酵母是人类重要致病真菌，其致病机理尚不清楚，治疗药物也很有限。毒性因子的表达是其致病过程的关键步骤，本申请拟继续研究新型隐球酵母主要毒性因子之一的漆酶受葡萄糖调控的分子基础。利用农杆菌介导T-DNA插入高通量突变技术得到一批解除了葡萄糖抑制的漆酶表达突变株，从中首选6株作为本项目的研究对象。利用Inverse PCR技术克隆被突变基因并构建靶向突变株，验证其参与了漆酶调控。利用RNA-Seq表达谱测序和蛋白质组学差异表达分析、Co-IP等手段，在全基因组水平上发现受该基因突变影响的其他基因的活动情况，推测突变基因参与的生物学过程：参与的通路和相互作用的靶蛋白，特别是其与已知的葡萄糖信号通路相互关系。本项目将进一步揭示葡萄糖抑制漆酶表达的机制，力争发现参与葡萄糖感应、信号传递的新蛋白，完善葡萄糖信号通路，从而加深对隐球酵母致病因子表达的认识。

隐球菌产生的主要毒力因子漆酶的表达受到高浓度葡萄糖（e.g.2%）抑制，葡萄糖产生抑制的信号途径尚不清楚。本计划拟寻找葡糖糖作为信号分子传导途径中的新的成员。首次证明三个新成员参与了葡萄糖对漆酶表达的抑制，包括：1）四跨膜蛋白家族的第二亚家族蛋白Tsp2-1p，属于国内外首次报道。 TSP2-1突变之后，漆酶的葡萄糖阻遏作用消失， 并且影响到荚膜产生和细胞壁的完整性，后者导致隐球菌对一些列压力敏感。tsp2-1Δ在2%的葡萄糖培养基上，漆酶基因LAC1处于组成型转录状态，而突变株的生长基本上没有收到影响，表明TSP2-1是葡萄糖抑制信号被中断所致。 2） 肌醇酰基转移酶基因GWT1 (编码inositol acyltransferase)，同样参与了葡萄糖的信号传导过程，这个基因编码的蛋白Gwtp在酿酒酵母中负责与细胞壁完整性相关的蛋白GPI-锚定生成。gwt1Δ的突变还导致细胞壁完整性破坏，使酵母对一些列压力产生敏感反应。这个结果表明GPI-锚定的一些蛋白可能与Tsp2-1p组成复合体，感应细胞外的葡萄糖浓度，产生或介导葡萄糖信号的传递。3）葡萄糖磷酸异构酶（phosphoglucose isomerase, EC5.3.2.9）编码基因PGI1在漆酶表达中的作用。 这个酶可逆催化葡萄糖6-磷酸生成果糖6-磷酸，是糖酵解和糖再生途径的关键酶，是必须基因，我们得到的突变子的T-DNA插入其启动子的区域，使其转录水平大幅度下降，只有野生型的2%。但是该条件突变使漆酶葡萄糖阻遏解除，同时隐球菌对其他碳源如果糖和甘露糖的不能利用，说明葡萄糖再生收到影响。与前两个突变子tsp2-1和gwt1表型高度相似，荚膜产生、细胞壁/细胞膜的完整性被破坏。PGI1作用的发现表明代谢物抑制（Metabolite repression）可能在隐球菌中存在并且涉及对漆酶的阻遏和表达。 ..以上工作预示，除已经发现的G蛋白-cAMP-PKA途径之外，葡糖糖的信号至少可能有两个新途径，其一是细胞表面的一些蛋白参与的，例如Tsp2-1和GPI-锚定的一些蛋白可能参与了上游的葡萄糖的感应，而不是六碳糖转运蛋白（Hexose Transporters）, 产生起始信号。 其二，葡萄糖代谢的中间产物可能产生阻遏作用。葡萄糖阻遏漆酶表达的信号途径比过