死亡素逆转NDM-1耐药菌对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机理研究

New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) producing bacteria develop extended resistance to β-lactam antibiotics, including carbapenem. The development of NDM-1 inhibitors, which can restore the susceptibility of NDM-1-producing bacteria to antibiotics, is currently one of the most popular research focus. In the previous researches, we innovatively discovered that thanatin (THA), an insect derived antimicrobial peptide, can not only exert bactericidal activity via membrane permeabilization, but also significantly inhibit the hydrolytic activity of NDM-1-producing bacteria to imipenem and reverse the drug resistance at sub-MIC. Accordingly, we hypothesize that THA inhibits the activity of NDM-1 by competing the active sites of NDM-1 with zinc ions and thereby restores the susceptibility of NDM-1-producing bacteria to carbapenem antibiotics. In this study, we are going to clarify the mechanism how THA inhibits the hydrolytic activity of NDM-1, to investigate its ability to restore the susceptibility of NDM-1-producing bacteria to carbapenem antibiotics, and to explore the effect on blocking the spreading of NDM-1 and blaNDM-1 gene mediated by outer membrane vesicles. This project will reveal a novel mechanism of THA to reverse the resistance of NDM-1-producing bacteria to carbapenem antibiotics, and provide a new strategy for the development of NDM-1 inhibitors.

产新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1）耐药菌对碳青霉烯等β-内酰胺类抗生素产生了广泛耐药。NDM-1酶抑制剂可恢复NDM-1耐药菌对抗生素的敏感性，是目前研究的热点之一。我们前期研究首次发现，昆虫来源抗菌肽死亡素（Thanatin, THA）除破膜杀菌作用外，还能在亚抑菌浓度下显著抑制NDM-1菌水解亚胺培南的活性，逆转该耐药菌对亚胺培南的耐药性。据此我们提出THA与锌离子竞争结合NDM-1酶活性位点，抑制NDM-1酶活性，恢复耐药菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性。为证实此假说，本课题拟在NDM-1蛋白、细菌和感染动物水平，开展THA抑制NDM-1酶活性，恢复NDM-1耐药菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性，并阻断耐药菌分泌外膜囊泡传播NDM-1酶和blaNDM-1耐药基因的研究。阐明上述问题将揭示THA逆转NDM-1耐药菌对碳青霉烯类抗生素耐药的新机制，为NDM-1酶抑制剂的研发提供新思路。

产新德里金属 β-内酰胺酶-1（NDM-1）的革兰氏阴性（G-）菌对几乎所有 β-内酰胺类抗生素广泛耐药，是导致严重感染和死亡的重要致病菌，目前在临床治疗尚无有效的抗菌药物可供选择。另外，NDM-1耐药菌亦可通过释放含有NDM-1酶和blaNDM-1耐药基因的外膜囊泡（OMV）播散耐药性，是加剧细菌耐药的重要机制。在前期工作中，我们证实了昆虫来源抗菌肽死亡素（Thanatin, THA）可破坏G-菌外膜结构，通过胞膜渗透作用发挥抗菌活性。而在低浓度下，THA亦可作为NDM-1酶抑制剂，在逆转细菌耐药性中发挥重要作用，其作用机制尚不清楚。阐明其机制将为治疗NDM-1耐药菌感染、遏制耐药性传播及研发新型NDM-1酶抑制剂提供新思路和重要理论基础。本课题就阐明THA抑制NDM-1酶水解活性的新机理、提出THA对抗细菌耐药的新途径、探索阻断G-菌耐药性播散的新思路三个方面展开研究。首先，我们从细菌层面对THA抑制NDM-1水解酶的作用进行了确证，并通过在蛋白水平研究揭示了THA通过与锌离子竞争结合NDM-1酶活性位点，发挥抑制NDM-1酶水解活性的新型作用机制，与已报道的NDM-1酶抑制剂相比，该机制具有选择性和安全性高的优势。第二，我们通过体外实验在细菌水平证明了THA与碳青霉烯类抗生素联合应用可有效恢复NDM-1耐药菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性，发挥协同或相加作用；在NDM-1耐药菌感染脓毒症小鼠模型中，THA与碳青霉烯类抗生素联合用药策略可有效降低重要脏器细菌滴度、缓解组织损伤、大幅提高脓毒症小鼠生存率。第三，我们确证了THA能够通过膜渗透作用破坏OMV结构，导致NDM-1酶及blaNDM-1耐药基因降解，有效阻断耐药性传播。综上所述，本课题首次揭示了THA在逆转NDM-1耐药菌耐药性中的作用及分子机制，验证了THA在阻断NDM-1耐药性传播中的有效性，为临床治疗NDM-1耐药菌导致的严重感染提供了新策略和理论基础。