CCCP逆转碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对粘菌素耐药性的分子机制研究

The emergence of colistin-resistance represents one of the most critical challenges in the treatment of infections caused by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP). We have previously found that the efflux pump inhibitor cyanamine aminobenzamide (CCCP) can significantly reverse colistin resistance caused by different mechanisms, suggesting that CCCP may not only act on efflux systems (such as AcrAB-TolC). Therefore, CCCP may reverse the resistance of CRKP to colistin by acting on the efflux system and lipopolysaccharide. In order to verify the above hypothesis, clinical CRKP and CR-hvKP, experimental colistin-resistant mutants, and isolates with reversed colistin-resistance acquired in our previous study will be used. The effects of CCCP on efflux pump and lipid A modification will be evaluated by drug accumulation assay, bacteria metabolic detection, lipid A isolation and structure analysis, membrane potential monitor, and qRT-PCR for the transcription of genes encoded for efflux pump and lipid A modification enzymes. Furthermore, whole genome sequencing and transcriptome sequencing will be used to find the target of CCCP in reversal of drug resistance. This promising project will provide the evidence for innovative strategies to combat the colistin-resistant CRKP.

粘菌素是当前治疗碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的最后防线，而粘菌素耐药CRKP的出现使临床治疗再陷困局。我们前期发现，外排泵抑制剂氰化碳氨基苯甲胺（CCCP）可明显逆转不同耐药水平的粘菌素耐药株，提示CCCP可能不仅仅作用于外排系统（AcrAB-TolC）。CCCP可能通过作用于外排系统和Lipid A等多方面逆转CRKP对粘菌素的耐药性。为验证上述假说，本课题拟对前期获得的CRKP亲体株、其粘菌素耐药突变子和CCCP逆转粘菌素耐药后的菌株，采用药物积累试验、细菌代谢活性检测、膜电位测定、Lipid A结构分析、编码外排系统和脂多糖修饰酶基因的表达水平检测，阐明CCCP对外排系统和Lipid A的作用；利用全基因组和转录组测序，寻找CCCP逆转耐药的作用靶点。揭示CCCP逆转CRKP对粘菌素耐药性的分子机制，为今后开发抑制CRKP粘菌素耐药性的体内药物提供重要依据。

粘菌素是当前治疗碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的最后防线，近年来粘菌素耐药的碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）已成为公共健康的新威胁。我们前期发现，外排泵抑制剂CCCP可显著逆转不同耐药机制的粘菌素耐药株对粘菌素的耐药性，包括mgrB突变、携带mcr-1基因，甚至天然耐药菌株，提示CCCP可能通过作用于外排系统和细胞膜等多方面逆转粘菌素的耐药性。为验证上述假说，本课题选取粘菌素耐药CR-hvKP、粘菌素天然耐药株和CCCP逆转耐药后的菌株，对其外膜通透性、内膜完整性、膜电位、ATP、全基因组和转录组等进行研究，揭示CCCP逆转粘菌素耐药性的分子机制。结果显示，在细菌外膜方面，对于粘菌素耐药的CR-hvKP，在CCCP单独作用及与粘菌素联合作用时，用于检测外膜通透性的尼罗红的荧光强度均显著升高（P<0.0001）。同时，在粘菌素天然耐药菌中也观察到了相同结果（P<0.0001），说明CCCP可显著提高菌株的外膜通透性以逆转粘菌素耐药性。然而，CCCP本身对粘菌素耐药菌株的内膜完整性影响较小（P>0.05）。透射电镜观察膜结构变化也印证了上述现象。此外，我们利用DiSC3(5)的荧光强度变化检测CCCP对细菌的膜电位影响。结果显示CCCP能引起粘菌素耐药菌株DiSC3(5)荧光强度的显著性降低（P<0.05），推断CCCP可通过显著增加膜负电荷引起DiSC3(5)的荧光强度降低，进而逆转粘菌素耐药。此外，CCCP对外排泵也有一定抑制作用。我们发现CCCP可显著降低细菌胞外的ATP含量并抑制外排系统基因的表达，进而抑制外排泵的作用。综上，CCCP能显著逆转粘菌素耐药菌株的粘菌素耐药性，其主要通过提高耐药菌的外膜通透性、增加膜外负电荷进而降低粘菌素的耐药性。同时，CCCP也可通过降低胞外ATP含量和抑制外排系统相关基因表达以抑制外排泵对粘菌素的外排作用。