肺炎克雷伯杆菌CTX-M耐药基因差异表达的机制研究

The extended spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae (KP) is one of major respiratory tract infective pathogens and CTX-M enzyme is the most popular ESBL throughout the world. The present studies show that the expression of blaCTX-M is heterogeneous which is regulated by a highly conserved promoter. And the molecular mechanism has not been completely understood yet. Our preliminary study has found that the difference of promoters activity are associate with the change of spacer sequences between the promoter and the blaCTX-M coding sequence. Therefore, we propose a hypothesis: the spacer sequences between the highly conserved promoter and the blaCTX-M coding sequence may play a key role in of blaCTX-M expression. In order to verify the hypothesis, we use green fluorescent protein as a reporter gene plasmid vector to recombine plasmid containing the conserved promoter sequences and different spacer sequences. By detecting the promoter activity and RNA-seq, we look for the key point in blaCTX-M gene expression and explore the possible mechanism of heterogeneous blaCTX-M gene expression. This research can play an important role in controlling the dissemination and infection of CTX-M-producing KP and provide innovative strategies and ideas for exploration in new antimicrobial drug target spots.

产超广谱β-内酰胺酶（Extended Spectrum β-Lactamase，ESBL）肺炎克雷伯杆菌是引起呼吸道感染常见致病菌之一，CTX-M酶是全球最流行的ESBL。目前研究发现，blaCTX-M基因启动子高度保守，但blaCTX-M表达具有差异性，机制不清。我们的预实验提示，启动子与blaCTX-M基因的间隔序列不同，blaCTX-M启动子活性也有差异。因此提出假说：保守启动子和blaCTX-M编码序列的间隔序列可能是CTX-M表达调控的关键元件。为验证这一假说，我们利用以绿色荧光蛋白为报告基因的质粒为载体，构建包含保守启动子和不同间隔序列的重组质粒，通过检测启动子活性和转录组测序，寻找对blaCTX-M基因表达起决定作用的关键环节，探讨blaCTX-M差异表达的可能机制。本研究将对临床控制产CTX-M KP菌株的传播和感染具有重要意义，并为寻找新的抗菌药物靶点提供策略和思路。

CTX-M是全球范围内最流行的超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamase, ESBL）。产ESBL的肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella Pneumoniae, KP）是引起呼吸道感染常见致病菌之一。前期研究发现CTX-M的启动子高度保守，但在 KP中的表达具有差异性，机制尚不清楚。因此提出“保守启动子和blaCTX-M编码序列的间隔序列可能是CTX-M表达调控的关键元件”的假说。本课题利用以绿色荧光蛋白为报告基因的质粒为载体，构建包含保守启动子和间隔序列的重组质粒，通过荧光显微镜、流式细胞仪，寻找对CTX-M表达起决定作用的关键元件，并通过药敏实验验证。结果提示：①多中心来源的158株KP菌株中，blaCTX-M-14是ESBL-KP菌株最常见的基因型。②ESBL-KP对碳氢酶类抗生素保持了较高的敏感性③blaCTX-M基因上游发现插入序列ISEcp1，启动子由ISEcp1提供且十分保守。④对于各类型blaCTX-M基因，ISEcp1与blaCTX-M编码序列之间的间隔序列有明显差异。⑤ISEcp1与blaCTX-M编码序列之间的间隔序列对blaCTX-M表达产生显著影响。⑥间隔序列中，blaCTX-M上游-17碱基、-22碱基和V序列是影响blaCTX-M表达的重要元件。-17位碱基C→T突变或第22位碱基C→A突变，减弱blaCTX-M的表达；V序列缺失增强blaCTX-M的表达。本课题提示保守启动子和blaCTX-M编码序列的间隔序列是CTX-M表达调控的关键因素。其中-17碱基、-22碱基和V序列是影响blaCTX-M表达的重要元件，对这三个元件进行突变和修饰将改变blaCTX-M的表达。本研究揭示了CTX-M在KP中差异表达的可能原因，对临床控制产CTX-M的 KP菌株的传播和感染具有重要意义，并为寻找新的抗菌药物靶点提供了策略和思路。