腺苷及A1型腺苷受体在系膜细胞参与糖尿病肾病肾小球高滤过状态形成中的作用及机制研究

Tubuloglomerular feedback (TGF) plays a critical role in regulating glomerular filtration rate (GFR) by paracrine effect of adenosine on adenosine A1 receptor. Glomerular mesangial cells also have positive A1AR expression and show decreased contraction in the early stage of diabetic nephropathy (DN), which are highly possibly to be involved in TGF weakening by contraction dysfunction in the development of glomerular hyperfiltration in early DN. In our program, firstly, we will examine the alteration of CD39, CD73 which mediates adenosine generation and A1AR expression of glomeruli and mesangial cells induced by DN or high glucose in vivo and in vitro. GFR of A1AR-/- diabetic mice will be evaluated and compared with wildtype mice. Further, we will test the effects of adenosine stimulation or A1AR agonists and antagonists or A1AR gene knockout on high glucose induced intracellular calcium reduction, hypertrophy, and nitric oxide generation in primary mice glomerular mesangial cells. Finally, the downstream mechanism including the roles of TRPC6, Cx43 as well as PTEN/AKT/mTOR pathway, and eNOS formation will be explored, respectively. All of the above is designed to testify that mesangial cells take part in TGF, and to explore the role of TGF in the development of glomerular hyperfiltration in early DN and the mechanisms involved.

腺苷与A1型腺苷受体（A1AR）介导的管球反馈（TGF）是调节肾小球滤过率（GFR）的重要机制。系膜细胞表达A1AR，并在糖尿病肾病（DN）早期出现收缩功能下降，很可能是参与TGF失衡进而导致肾小球高滤过的重要因素，但尚无证据。本项目通过体内、外实验，观察糖尿病/高糖状态对肾小球及系膜细胞腺苷生成（CD39、CD73表达）和A1AR表达的改变，对比野生型与A1AR基因敲除型糖尿病小鼠GFR差异，进而研究腺苷刺激或A1AR激动、抑制或敲除对高糖所致原代小鼠系膜细胞钙离子浓度下降、细胞肥大及一氧化氮分泌的影响，最后探讨其中的机制是否分别与TRPC6、细胞间隙连接蛋白以及eNOS生成有关。期望验证在糖尿病状态下系膜细胞通过A1AR表达或功能异常导致收缩功能障碍，参与TGF失衡，进而导致GFR升高，为证明系膜细胞直接参与TGF提供依据，并为解析TGF在DN肾小球高滤过发生中的作用及机制开辟新方向。

腺苷与A1型腺苷受体（A1AR）介导的管球反馈（TGF）是调节肾小球滤过率（GFR）的重要机制。系膜细胞具备收缩功能，并表达A1AR，很可能参与糖尿病肾病早期TGF失衡进而形成肾小球高滤过的过程，但暂无证据。本研究通过体外实验，观察到1）小鼠系膜细胞能够表达腺苷合成限速酶CD39、CD73，同时也能够表达A1AR，并在高糖刺激下表达下调。证明系膜细胞参与高糖对管球反馈的抑制，同时说明系膜细胞很可能在糖尿病所致肾小球高滤过状态的形成中发挥了作用。2）高糖刺激导致小鼠系膜细胞收缩能力下降，加用腺苷或A1AR激动剂能够逆转这种下降，证实高糖对系膜细胞收缩能力存在影响，并且提示腺苷分泌的不足和A1AR的下调参与了高糖抑制系膜细胞收缩能力的过程，为腺苷及A1AR参与介导了高糖所致的肾小球高滤过提供了进一步的证据。3）介导钙离子内流的TRPC6蛋白在高糖环境下表达下降，然而在高糖同时加用腺苷或A1AR激动剂后表达再次升高，提示腺苷及A1AR介导的高糖所致系膜细胞收缩能力下降很可能与钙离子内流的减少有关，为揭示腺苷和A1AR参与糖尿病肾病早期肾小球高滤过状态的更深机制提供了依据。在体内实验方面，本研究尝试使用STZ建立糖尿病肾病小鼠模型，虽成功诱发糖尿病，但因死亡率较高未能进行肾脏病相关研究。此后，我们引进了db/db小鼠（先天性2型糖尿病小鼠），建立了使用FITC标记的菊粉在清醒状态下检测小鼠GFR的方法，从8周龄至28周龄监测db/db小鼠GFR并与正常对照组进行对比，观察到8周龄至20周龄的db/db小鼠GFR均显著高于对照组小鼠，自第24周龄开始GFR下降至与对照小鼠接近的水平，获得了糖尿病肾病早期肾小球高滤过状态的小鼠模型。注射A1AR激动剂后，观察到db/db小鼠肾小球高滤过状态得到改善，进一步证实A1AR的下调在糖尿病所致肾小球高滤过状态形成中发挥了重要作用。综上，本研究为系膜细胞参与糖尿病肾病早期肾小球高滤过的发病过程提供了更新更确切的证据，并一定程度上阐述了其中的机制，为日后研发相关药物提供了一定的理论基础。