基因遗传变异对锰暴露工人血浆锰和细胞毒作用的遗传调控

The plasma manganese levels can sensitively reflect the load of internal exposure among manganese exposed workers, but the individual difference is very big, which suggest the effects of genetic susceptibility. Our team previously found that different toxic effects were caused by the genetic characters even in the same enviroment of manganese exposure. Our study hypothesis is that genetic variations in the metabolism pathway of manganese can affect the absorption, transportion, and binding, and then regulate the plasma manganese levels and cell toxic effects among different manganese exposed workers. Based on the constructed Guangxi manganese exposure healthy cohort, we will choose 600 smelters as the exposed group and 300 inter-controls and then detect their plasma manganese levels. The strategies of candidate genes and systematic biology are combined.Those TagSNPs of the key genes in the metabolism pathway including Tf/TfR/DMT1,ZIP4/ZIP8/ZIP14, and TPRM4/TPRM7 are genotyped. The Illumina Exome array is also used to carry out the association analysis, and the genetic loci will be systemic recognized in the population study. Moreover, the CRISPR/Cas9 gene targeting will be used to site-directed mutagenesis for the lung A549 and PC12 cell lines, and then the gene expressions, manganese uptake, and cell toxic differences are respectively detected for different genotyped cell lines after manganese toxication, which will validate the functional features of these genetic variations in the cell study.

锰作业工人血浆锰浓度可敏感反映内暴露负荷，但个体间差异很大，提示遗传易感性发挥作用。我们前期研究发现，同样锰环境暴露的工人由于遗传特征不同导致毒作用差异。本研究假设为"锰代谢转运通路基因的遗传变异影响机体对锰的吸收、转运与结合，对血浆锰的个体差异和细胞毒作用发挥遗传调控作用"。本项目基于已建立的广西职业锰健康队列，选择600例冶炼工组和300例内对照组检测血浆锰浓度。结合候选基因策略与系统生物学策略：选择通路上关键基因Tf/TfR/DMT1、ZIP4/ZIP8/ZIP14、TPRM4/TPRM7进行标签多态性位点（TagSNPs）基因分型；采用外显子组芯片进行关联分析，在人群水平系统识别影响血浆锰的基因位点。再采用CRISPR/Cas9 打靶系统对肺A549细胞和PC12神经细胞进行定点突变，检测染锰后不同基因型细胞系基因表达、锰摄取能力和细胞毒作用，在细胞水平验证基因位点的遗传调控机制。

本项目结合职业流行病学和分子毒理学研究，首先探讨了血浆锰是否可作为锰暴露的内暴露标志物：基于广西职业锰暴露工人队列，选择234例工人按外暴露分为低、中、高暴露组，各组血浆锰浓度中位数分别为2.46μg/L、3.61μg/L、2.40μg/L，差异无显著性，P>0.05; 另选择805名锰暴露工人采用ICP-MS技术检测22种血浆金属浓度，发现各组血浆锰浓度也无显著性差异，P>0.05，血浆中锰与钴呈正相关，相关系数r=0.17, P<0.05。但是我们通过检测234例工人血细胞锰浓度，发现各组浓度随着个体外暴露水平增加而显著增加，分别为11.52μg/L(0.23-50.49)、20.23(1.05-68.24)、20.41μg/L (1.12-112.67)，差异有显著性，P<0.05。其次，由于锰暴露工人血浆锰浓度个体差异大，我们结合采用候选基因策略和全基因组策略研究了影响血浆锰浓度的易感基因及遗传变异位点：基于候选基因策略，选择锰代谢通路上32个关键基因共122个TagSNPs，对805例样本进行基因分型，均未发现有意义的基因及位点，P>0.05；进而我们基于全基因组关联研究策略，采用外显子全基因组芯片，发现汉族人群中12个基因22个SNPs和壮族人群中7个基因11个SNPs均与血浆锰浓度相关，采用生物信息学分析显示这19个基因与离子转运体的功能有关。此外，我们将上述位点在防城港男性健康队列的1799名汉族男性人群进行验证，结果显示CACNB2基因kgp11820519位点与血浆锰浓度显著相关，P<0.05。最后，我们采用体外细胞实验研究了CYBRD1基因在细胞锰摄取中的作用: 采用siRNA瞬时转染H9C2细胞株构建CYBRD1低表达细胞系，对细胞进行200μM Mncl2染毒处理，结果显示：siRNA干扰CYBRD1组H9C2细胞胞内锰的浓度为10.35±1.92μg/L，显著高于空白对照组（2.90±0.29μg/L）和阴性对照组（3.58±2.67μg/L），P<0.05，提示 CYBRD1基因可能是细胞转运锰到细胞外的关键基因，但其生物学功能还需进一步研究。综上，本项目发现血细胞锰而非血浆锰可作为职业锰暴露工人的内暴露标志物，并从分子遗传机制角度评价职业锰暴露人群血浆锰的个体遗传易感性，可以为职业锰暴露人群易感个体的筛选和早期个体化预防提供科学依据。