辐射诱导肿瘤细胞死亡新途径：NADPH氧化酶启动线粒体恶性循环损伤研究

Induction of ROS-mediated damage in cancer cells by radiation has been considered as a potential therapeutic strategy to preferentially kill cancer cells. Mitochondria is one of the major sources of reactive oxygen species (ROS) in cells but also is the target of cellular ROS. ROS attacking mitochondria lead to dysfunction, which will further enhance the production of mitochondrial ROS. Finally, a feed-forward vicious cycle between mitochondria and ROS is created to induce cell death. NADPH oxidase can be activated to elevate the level of ROS within a few minutes after stimulation by radiation. Activatory NADPH oxidase maybe induce the feed-forward vicious cycle of mitochondria, NADPH oxidase activation play a “primacord” role in the damage of mitochondria. Once mitochondria enter a vicious cycle phase, the fate of cells is not controled by NADPH oxidase. The real murderer is mitochondria itself. This study will investigate the vicious cycle hypothesis and reveal the source of long-lasting ROS formation after radiation exposure. This is a possible new mechanism for heavy ion irradiation-induced cancer cell death.

射线能够引起肿瘤细胞内氧化胁迫、导致肿瘤细胞死亡，这是放射治疗的关键机理之一。由于线粒体DNA（mtDNA）没有组蛋白包被，使其与核DNA相比更容易受到活性氧（ROS）的攻击。一旦mtDNA受损，线粒体就会发生能量代谢障碍并产生更多ROS。这样，在mtDNA与ROS之间产生恶性反馈循环。NADPH氧化酶激活后可以产生短暂ROS，如果这部分ROS用来攻击mtDNA就能够启动线粒体恶性循环。在此过程中，NADPH氧化酶可能起到“导火索”的作用，线粒体恶性循环损伤可能是引起细胞死亡的“真正凶手”。本课题研究X射线和碳离子辐照后肿瘤细胞内mtDNA损伤的时空特性及始动因素，并采用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ 以及NADPH氧化酶抑制剂APO加以干预，试图阐明线粒体与NADPH氧化酶在辐射诱导肿瘤细胞死亡中的相互关系并确定辐照后引起持续氧化胁迫的活性氧的来源。有望揭示一条辐射诱导细胞死亡的新途经。

目前的常规放疗一般采用X-射线或γ-射线等电离辐射粒子；除此之外，近来发现某些带电的重离子（如氮、碳、氧、氖等）对肿瘤也具有较好的治疗效果。无论哪一种放疗方式，辐照时所产生的活性氧自由基介导的肿瘤细胞损伤都是射线杀伤肿瘤的关键因素，这也就是电离辐射间接生物损伤效应。但是，由于射线能够直接攻击细胞、引起多种生物大分子的损伤，因此电离辐射直接生物损伤效应一直被认为在放射治疗过程中起到主导作用。再加之未能找到一个持续活性氧自由基的来源，电离辐射的间接生物学损伤作用一直以来备受争议。本项目提出辐射诱导NADPH氧化酶活化产生快速超氧阴离子自由基率先攻击线粒体DNA（mtDNA）引起呼吸链功能异常，大量ROS泄露并进一步导致mtDNA损伤和活性氧再次泄露的这一恶性循环过程可能是放射诱导肿瘤细胞持续氧化胁迫的根本原因。证实这一推论可为电离辐射间接生物学损伤效应在放射治疗中的作用提供理论依据。我们研究发现碳离子束辐照HepG2细胞引起大量p47phox亚基往细胞膜上转位，激活NADPH氧化酶。同时，导致严重的线粒体DNA损伤、膜电势降低、线粒体来源的超氧阴离子大量生成、线粒体内8-OHdG含量升高，最终导致肿瘤细胞凋亡；而当用NADPH氧化酶抑制剂APO预处理后再给辐照，线粒体各项损伤指标得到缓解，细胞凋亡数量也明显降低。单细胞电泳和克隆实验结果发现，碳离子束辐照对线粒体缺失的HepG2 ρ0细胞的损伤远远小于正常的HepG2 ρ+细胞。结果表明：1. 碳离子束辐照能够通过激活NADPH氧化酶启动线粒体恶性循环损伤。2. 线粒体恶性循环损伤是辐照后细胞内持续活性氧产生的来源。3. 碳离子束辐照导致HepG2细胞死亡过程中，NADPH氧化酶仅仅起到诱导作用，而线粒体恶性循环损伤是主要的执行者。此项研究首次证明碳离子束可以激活NADPH氧化酶引起线粒体恶性循环损伤，这有可能是重离子辐照诱导肿瘤细胞死亡的一条潜在的新途径。为进一步揭示重离子辐射间接生物学损伤效应提供了新证据，对重离子治癌研究具有重要意义。