双重标记iPS细胞来源的肝干细胞与大鼠肝纤维化病理微环境相互作用的研究

诱导多能干细胞（iPS细胞）是近年发现一类具有和胚胎干细胞特性相似的干细胞，其来源于体细胞并具有多向分化潜能，具有避免免疫排斥、不涉及伦理道德等优势，具有重要的临床应用和研究价值。干细胞在体内的种植、分化及发挥作用受所处病理微环境的调控，其与微环境的相互作用目前尚缺乏深入研究。我们拟利用腺病毒载体将Oct4, Sox2, Klf4 和Utf1基因导入大鼠成纤维细胞诱导成iPS细胞，经体外淤胆血清筛选、诱导为肝干细胞后，SPIO和PKH26双重标记，在造模不同阶段经门静脉移植入肝纤维化大鼠模型中，活体示踪肝干细胞在体内各脏器的种植和分布，采用组织学、免疫细胞化学、Western blot等技术，观察移植细胞对纤维化病理微环境的影响，同时研究病理环境对其在肝脏中的种植、分化的影响，了解iPS细胞来源的肝干细胞在肝纤维化发生过程中所起的作用及机制，从而为肝纤维化的治疗提供新的思路。

目的：诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）具有与胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）相似的表型和功能，能多向分化特别是向肝细胞方向分化，从而成为肝病治疗最有希望的细胞。本研究探讨iPSCs诱导分化的肝细胞样细胞（hepatocyte-like cells, HLCs）移植对CCl4所致肝纤维化大鼠的影响。.方法：利用诱导因子通过三步法将大鼠iPSCs向肝系细胞方向分化，从基因和蛋白水平评估HLCs标志表达和功能。体外将iPSCs-HLCs移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内，通过检测肝功能、肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）活化、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）合成与降解、肝细胞增殖等指标，评价其对大鼠肝纤维化的影响。.结果：培养诱导20天的大鼠iPSCs分化为HLCs，表达肝系细胞标志白蛋白（albumin, ALB）、甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）、细胞角蛋白8、18、19（cytokeratin 8,18, 19, CK8, 18, 19）和肝细胞核因子-4α （hepatocyte nuclearfactor-4α, HNF-4α），并且具有糖原贮备、尿素分泌、靛青绿（indocyanine green, ICG）和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL） 摄取能力。体内研究显示，与模型组相比，细胞移植组大鼠肝功能改善，胶原面积减少，-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin, α-SMA）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）蛋白和I、III胶原（collagen types I, III, COL I, III）mRNA表达下降，基质金属蛋白酶-2、3、9 (matrix metalloproteinase-2、3、9, MMP-2、3、9)，肝细胞生长因子（hepatic growth factor, HGF）mRNA 表达上调。.结论：利用诱导因子通过三步法可有效地将大鼠iPSCs诱导分化为HLCs。iPSCs-HLCs移植能有效抑制大鼠肝纤维化，改善纤维化大鼠肝功能。