基于纳米抗体的酶触发点击化学-等离子体ELISA检测赭曲霉毒素A生物传感体系的构建研究

Ochratoxin A (OTA) is a common food contaminant, and it can cause multiple biological toxities to human beings and animals. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and colloidal gold immunochromatography (CGI) are commonly used for the routine screening of OTA. ELISA has the advantage of high detection sensitivity, but its operation is relatively complicated and time-consuming. CGI has the advantages of easy operation, fast detection and result analysis by naked eyes, while its detection sensitivity is relatively low. Enzyme-triggered click chemistry-plasmonic ELISA (ECC-pELISA) has the advantages of both methods, and the preparation of detection antibody with higher affinity is a key point to further improve its detection sensitivity. In this proposal, the molecular recognition mechanisms of anti-OTA nanobody (Nb) prepared in our previous work will be studied with homology modeling and molecular docking. Nb with improved affinity will be developed by directed modification and then applied to construct nanobody-alkaline phosphatase (Nb-ALP) fusion protein. The feasibility of Nb-ALP fusion protein’s application to establish an ECC-pELISA biosensing system will be further investigated. This study provides a model basis of directed modification for engineered antibodies, and also a new approach for fast, visual and highly sensitive detection of small molecular compounds.

赭曲霉毒素A（OTA）是一种常见的食品污染物，对人和动物具有多种生物毒性作用。酶联免疫吸附分析（ELISA）和胶体金免疫层析（CGI）是OTA例行筛查中常用的两种方法：ELISA的检测灵敏度高，但操作相对繁琐耗时；CGI具有操作简单、检测快速、裸视判读结果等优点，但检测灵敏度相对偏低。而基于酶触发点击化学的等离子体ELISA（ECC-pELISA）兼具ELISA和CGI的优点，制备高亲和力的检测抗体是实现进一步提高其检测灵敏度的关键。本项目拟在已获得的抗OTA纳米抗体（Nb）的基础上，采用同源建模和分子对接技术探析抗OTA Nb的分子识别机理，并通过定向改造获得具有更高亲和力的Nb，进而制备纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白并探讨其运用于构建ECC-pELISA生物传感体系的可行性。本研究能为其他基因工程抗体的定向分子改造提供模式依据，并为其他小分子化合物的快速、可视化、高灵敏检测提供思路。

赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）是一种常见的食品污染物，对人和动物具有多种生物毒性作用及致癌性。因此，建立快速、灵敏的OTA检测方法对于保障消费者食品安全和生命健康具有重大意义。酶联免疫吸附分析（ELISA）和胶体金免疫层析（CGI）是OTA例行筛查中常用的两种方法。ELISA检测灵敏度高，但操作相对繁琐耗时；CGI具有简单快速、裸视判读结果等优点，但检测灵敏度相对偏低。本项目针对模式小分子OTA在实际检测中遇到的快速、可视化、高灵敏检测的关键问题，以纳米抗体（nanobody, Nb）作为识别探针，开展了基于纳米抗体的酶触发点击化学-等离子体ELISA（enzyme-triggered click chemistry-plasmonic ELISA, ECC-pELISA）生物传感体系的构建研究。第一，利用纳米抗体的单域特征和易于遗传操作的优点，对OTA特异性纳米抗体Nb28进行体外亲和成熟研究。经同源建模、分子对接和丙氨酸扫描确定了Nb28与OTA互作的四个关键氨基酸位点，将上述四个关键氨基酸位点进行两两配对并制备了两个双位点定点饱和突变噬菌体展示文库，经淘选鉴定后获得了亲和力更高的纳米抗体突变子Nb-G53Q&S102D，其IC50为0.29 ng/mL，KD值为52 nM，分别比Nb28低1.4倍和1.36倍。第二，选择Nb28高亲和力的突变子Nb-G53Q&S102D，并利用C4bpα自组装肽制备了Nb-ALP七聚体融合蛋白（Nb-C4bpα-ALP）。以Nb-C4bpα-ALP为识别探针，通过优化Cu2+浓度、抗坏血酸磷酸盐浓度、去磷酸化时间等实验条件，初步构建了基于ALP触发CuAAC检测OTA的ECC-pELISA生物传感体系，其裸眼检测阈值为0.63 ng/mL。综上，本研究首次对免疫库筛选获得的纳米抗体进行体外亲和成熟，结合筛选结果及模拟仿真发现，氨基酸残基的极性、疏水相互作用和侧链空间位阻对于抗体与抗原相互作用至关重要，研究结果对解析纳米抗体结构与功能的关系以及纳米抗体的体外亲和成熟具有一定的参考价值。此外，检测OTA的ECC-pELISA生物传感体系的建立，解决了传统ELISA平台与快速、高灵敏、可视化检测的统一问题，为小分子污染物的可视化、高灵敏快速检测提供了模式依据。