5’UTR区等位变异对小麦休眠相关基因TaAFP-B的调控作用机理研究

Seed dormancy is a major factor that controls the PHS under wet weather condition. During seed development, ABI5 can regulate the sensitivity of embryo to ABA, and play an important role in the establishment of the mechanism of desiccation tolerance and the embryo dormancy. AFP (an ABI5-binding protein) facilitates ABI5 proteasome degradation which is a novel negative regulator of ABA signaling by facilitating the degradation of ABI5, so AFP plays an important role in seed dormancy. In our previous studies found that different allelic variation, which had been provided to be associated with depth of seeds dormancy, existed in 5’UTR regain of TaAFP –B in Chinese white-grained wheat, but mechanism of regulation is not known yet about how the different allelic variation regulate transcription and translation. The major methods in this project, including PCR, 5’RACE, RT-qPCR, transient expression, stable expression and date statistic, will be used to study the transcription initiation site, mRNA half-life, pattern and level of transcript expression, and protein expression level. in order to clarify the mechanism of different allelic variation in 5’UTR to transctiption and translation of TaAFP –B, and develop a molecular marker associated with PHS tolerance. Above these will be further improve the molecular mechanism of PHS tolerance and provide the parent material for PHS resistance breeding in wheat.

穗发芽严重影响小麦籽粒的产量和品质。种子的休眠特性是影响小麦穗发芽抗性的主要因素。拟南芥ABI5基因能够调节发育中的胚对ABA的敏感性，在种子干燥耐受机制的建立和胚胎的休眠机制中发挥重要作用。AFP是ABI5的结合蛋白，通过降解ABI5蛋白影响种子的休眠特性。我们在前期研究中发现，在不同休眠特性的白粒小麦品种中，TaAFP-B基因5’UTR区存在与种子休眠特性相关的等位变异，但其对调控的作用机理尚不清楚。本项目将主要利用PCR、5’RACE、 RT-qPCR、瞬时表达、稳定表达和数据统计的技术和方法研究TaAFP-B基因5’UTR区等位变异对转录起始位点、 mRNA半衰期、转录本表达特性和蛋白质翻译水平的影响，阐明5’UTR区等位变异对TaAFP-B基因的调控作用机理，并开发与穗发芽抗性相关的分子标记，进一步完善小麦抗穗发芽分子机理，并为抗穗发芽育种提供亲本材料。

TaAFPs是AtAFP的同源基因，作为ABA信号途径的负调控因子参与胚的萌发和种子的休眠。本项目在前期发现TaAFP-B基因的两个等位基因TaAFP-Ba（存在4bp的插入）和TaAFP-Bb在5′UTR区存在4-bp的InDel的基础之上，进一步对其功能进行研究，结果如下：.1、一个与穗发芽抗性密切相关的STS标记被开发，并命名为AFP-BF，属于TaAFP-Ba等位基因型的材料与中感穗发芽相关，属于TaAFP-Bb等位基因型的材料与抗穗发芽相关；.2、在自然品种中，TaAFP-B基因在5′UTR区存在的4bp的InDel影响了该基因转录本的表达水平，在不同发育阶段的种子中，TaAFP-Ba等位基因型材料的转录本表达量均高于TaAFP-Bb等位基因型材料中转录本的表达量；.3、TaAFP-B基因在5′UTR区存在的4bp的InDel影响了该基因mRNA的稳定性，即等位基因TaAFP-Ba mRNA的稳定性显著高于TaAFP-Bb的稳定性。.4、对TaAFP-B基因5′UTR区域的差异片段构建到瞬时表达载体中，启动红色荧光蛋白和GUS蛋白。结果表明具有4bp插入的启动子可增强报告基因的表达，而缺失片段则会减弱报告基因的表达。.5、通过农杆菌介导把带有5′UTR区的两个等位基因的编码序列分别转化水稻和小麦受体，分别获得了单拷贝插入的转基因株系；.6、在水稻和小麦的两种转基因株系中，TaAFP-B转录本的表达量趋势均为蜡熟期种子>根>茎>叶；.7、在转基因水稻和小麦的单拷贝株系中，TaAFP-B基因在5′UTR区存在的4bp的InDel影响了该基因转录本的表达水平，在转基因材料的各组织中总是转基因材料TaAFP-Ba<TaAFP-Bb类型材料中转录本的表达量；.8、在转基因水稻种子中，TaAFP-B基因在5′UTR区存在的4bp的InDel影响了内源激素ABA的含量，5´UTR区的4-bp 插入增加了转基因水稻种子中ABA的含量，可能进一步影响了转基因水稻种子的GI值和茎秆的发育；.9、在转基因水稻种子中，TaAFP-B基因在5′UTR区存在的4bp的插入增加了转基因水稻中TaAFP-B融合蛋白的表达量；.10、5´UTR区的4-bp 插入降低了转基因小麦的穗发芽抗性，增加了株高、百粒重和抗倒伏性。