基于结构的耐药流感病毒抑制剂的设计、合成及生物活性研究

Recent outbreaks of new influenza viruses, such as 2009 A/H1N1 and 2013 avian H7N9, have caused public panic and economic losses. The emergence of resistant strains to currently available drugs (zanamivir and oseltamivir) further necessitates effective means to prevent and treat these contagious pathogens. Previously, based on the 3D structure of target protein, the viral surface tetrameric neuraminidase (NA), we have developed a novel anti-influenza agent, which has four terminal zanamivir pharmacophores covalently linked on a small core molecule. This compound has showed 30-fold higher inhibitory activity against a NA derived from a drug-resistant viral strain than monovalent zanamivir. Here we propose the more comprehensive studies on the biochemical and physiological effects of this compound. These include both the in vitro and in vivo evaluations of the inhibitory effect against both drug-resistant and -nonresistant strains and their NAs, as well as the mechanism-of-action studies. The optimization of structure and activity of the compound is also incorporated in the research program to obtain potential anti-influenza drug candidate that is effective to both resistant and nonresistant strains. This research project may provide a valuable example of the application of structure-based drug design.

近年来，新型流感的爆发率呈上升趋势（如2009年甲型H1N1和2013年H7N9禽流感），同时针对传统抗流感药物（扎那米韦和奥司米韦）的耐药病毒已大量出现，如何快速地发现新一代抗流感药物已成为流感防控中的一个重要问题。在前期研究中，根据流感病毒表面囊膜蛋白Neuraminidase（NA）四聚体的构象以及药物结合位点的空间分布特征，设计并合成了一种以NA为靶标、含有四个扎那米韦药效团的四价流感病毒抑制剂。初步活性评价表明该化合物对耐药毒株NA的抑制强度约为扎那米韦的30倍。本课题拟对该化合物进行更加深入、广泛的药效学评价，选择不同亚型的耐药与非耐药NA及病毒分别在分子水平、细胞水平以及动物（小鼠）水平上研究其活性和作用机制，并通过构效关系优化其结构，旨在获得可高效抑制流感病毒（包括耐药毒株在内）的抑制剂，为发现创新型抗流感药物提供基础。

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的人畜共患呼吸道传染病。流感病毒具有变异快、传播性高、危害性大等特点。而且，对已有抗流感药物扎那米韦和达菲的耐药病毒株已经十分普遍。如何快速高效地设计出新型抗流感药物（尤其针对耐药病毒株有效）具有十分重要的科学以及和应用价值。本项目充分分析了抗流感药物扎那米韦（ZNV）与靶点蛋白神经氨酸酶（NA）的结合方式以及结合位点在NA四聚体上的空间分布特点，并结合计算机模拟技术设计出了一系列四价扎那米韦抑制剂分子TZs，包括TZ3、TZ6和TZ12。然后，我们通过模块化有机合成的方法合成了TZs。接下来，本论文分别在蛋白水平、细胞水平以及动物水平上评价了TZs的药物活性，结果发现TZ12对不同亚型的流感病毒(包括季节性流感病毒H3N2和禽流感病毒H7N9)，尤其对耐药株流感病毒表现出了较扎那米韦更强的抑制活性。为了进一步明确TZ12与NA蛋白之间的作用机制，本论文进行了表面离子共振（SPR）实验、X晶体衍射实验、超速离心分析（AUC）实验以及透射电镜实验（TEM）。其中，SPR结果显示TZ12与NA蛋白之间的亲和力在pM级别。并且综合结构生物学、AUC和TEM的研究结果表明TZ12的四个扎那米韦药效团可以同时进入到NA四聚体上的四个活性位点中，从而与NA四聚体形成热力学更加稳定的1：1复合物。这些研究从机制上解释了TZ12具有高效抗流感病毒活性的原因。总之，本项目设计的TZ12分子具有进一步进行临床前开发的潜力。同时，本论文的研究结果也为其他多价抑制剂的设计提供了更加合理有效的设计思路，而且也是对基于靶点蛋白结构进行药物设计的一个重要补充。