基于唾液酸糖链的流感病毒富集和检测技术的研究

Accurate diagnosis of influenza viruses is difficult and generally requires a complex process because of viral diversity and rapid mutability. Preciously we have developed an easy and rapid method for the detection and differentiation of influenza viruses by using glycan-functionalized gold nanoparticles (gGNPs). The method was based on the aggregation of gGNP probes on the viral surface, which was mediated by the specific binding of the virus to the glycans (ACS Nano. 2014, 8, 4600; Biosens Bioelectron. 2017, 91, 46). In this proposal we would develop a simple strategy for the enrichment and purification of influenza viruses by using glycan-functionalized magnetic nanoparticles (gMNPs). This gMNP-based viral enrichment would be used prior to the gGNP-based detection and should markedly increase the sensitivity and reliability of the gGNP-based detection. The proposed strategy combining gMNP and gGNP technologies would permit fast, sensitive, and portable sensors that may be used in the clinical diagnosis and surveillance of influenza viruses, aiding in viral control and prevention. The scientific programs of this proposal include the synthesis of sialylated glycans and gMNPs, the evaluation of “gMNP+gGNP” detection system using diverse influenza viral strains, and the mechanistic study on the interaction between influenza viruses and the nanoparticles.

流感病毒类型众多且宿主范围广泛，各种亚型在野鸟、家禽和人类中反复流行，不断重组和进化，简单快速的便携式现场检测技术（POC）对于流感的防控具有重要意义。在前期工作中（ACS Nano 2014; Biosens Bioelectron 2017），申请人将流感病毒的受体唾液酸寡糖负载到金纳米粒子上，发展了一种基于糖-金纳米粒子（gGNP）的流感检测新技术，该方法不依赖实验室专有设备和抗体、核酸等不稳定的生物制剂，特别适用于POC操作。本项目拟在此基础上发展一种基于糖-磁纳米粒子（gMNP）的流感病毒捕获新技术，服务于gGNP检测所需的上游样品纯化，并与gGNP协同构建出一套完整、灵敏的流感病毒检测方法，为最终开发出POC检测试剂盒产品提供技术支持。主要研究内容包括唾液酸寡糖及gMNP的合成、使用大量病毒样品对“gMNP+gGNP”检测体系的验证、以及纳米粒子与流感病毒相互作用的机制研究。

流感病毒类型众多且宿主范围广泛，各种亚型在野鸟、家禽和人类中反复流行，不断重组和进化，简单快速的便携式现场检测技术（POC）对于流感的防控具有重要意义。. 本项目以四氧化三铁磁纳米粒子作为载体，将能与流感病毒表面HA或NA蛋白有特异性相互作用的唾液酸寡糖链或扎那米韦分子，通过共价键修饰到磁纳米粒子表面，最终制备了两类糖基功能化的磁纳米粒子。对制备出的糖基功能化的磁纳米粒子进行了表征，表明磁纳米粒子表面负载有丰富的唾液酸寡糖或扎那米韦分子，且在水相中具有良好的单分散性和稳定性，同时具有超顺磁性以及强的磁响应能力。证实了上述两类糖基磁纳米粒子可以快速（<30min）、高效（富集效率＞92%）高效富集分离各种亚型的流感病毒（包括H1N1、H5N及副流感病毒等）。. 通过使用模拟流感病毒感染咽拭子样品以及采自医院和养禽场的疑似流感病毒感染的真实拭子样品（80例），证明了糖基磁纳米粒子富集分离预处理可以显著提高传统流感病毒检测方法（ELISA和PCR）的灵敏度；而且富集分离出的流感病毒可以直接通过热裂解释放病毒RNA，然后用于PCR，免去了传统复杂的RNA提取操作，从而大幅简化了PCR检测的操作过程。初步探究了将糖基功能化金纳米粒子体系用于糖基磁纳米粒子富集分离出的流感病毒检测，验证了基于糖基磁纳米粒子的富集分离方法可与其他新型流感病毒检测方法相结合。. 本项目以糖基磁纳米粒子为工具，建立了一种快速、高效富集分离流感病毒的方法，有利于下游的流感病毒检测。与传统的免疫磁珠等相比，糖基磁纳米粒子具有制备简单、成本低、稳定性高、通用性强以及可以重复利用等优点。方便、快捷、精准的便携式现场检测技术是未来发展的方向，本研究发展的糖基磁纳米粒子由于其独特的性质便于集成化和自动化，为进一步开发流感病毒快检方法提供了理论支持和技术储备。