SUMO化与双微体形成之间关系研究

To determine role and target protein of SUMOylation in the process of DMs formation, in this study, by screening SUMOylation associated moleculars, the roles of SUMOylation cycle-related molecules for the amplification of double minutes in tumor cells and tumor cell biologic functions will be researched briefly. Futhermore,the proteins of two cell lines (UACC-1598 DMs less / rich) which have the same genetic background are collected and marked by demethylation in vitro. Then difference SUMOylation target protein is screened by 2-D page.Using GST-SIM and GST-SIM2r peptides as bait, the difference proteins of the two cell lines which were effected by SUMO:SIM are detected using GST-pull down. Then, to reveal the affection of SUMOylation on DMs formation mechanism, the role of SUMOylation target protein is detected on DMs formation. The present study explains expression and regulation mechanism of DMs formation from the level of protein post-translation modification. The study not only open a new horizons to reveal the mechanism of the formation of double minute chromosomes, but also provide a new idea for the removal of double minute chromosomes and cancer treatment.

为明确双微体产生过程中SUMO化修饰的功能及靶点，本研究利用双微体所携带的MYC/MYCN蛋白所激活的报告基因筛查SUMO化相关分子，初步探究SUMO化循环相关分子对肿瘤细胞中双微体扩增的影响及其对肿瘤细胞生物学功能影响。进一步针对相同遗传背景下的两个亚克隆细胞系（UACC-1598DMs 缺失/富集）蛋白进行体外二甲基化后进行双向电泳实验研究，筛查有差异的SUMO化靶蛋白。同时应用GST-pull down技术，应用GST-SIM和GST-SIM2r作为诱饵，检测两细胞系受SUMO:SIM影响的差异蛋白。进而研究靶蛋白SUMO化对双微体形成的影响，揭示SUMO化在双微体形成机制中的作用。该研究将从蛋白翻译后修饰水平上解释肿瘤双微体形成中的表达和调控机制，不仅为揭示双微体的形成机制打开新的视野，而且为双微体的去除及肿瘤治疗提供有价值的的新思路。

本研究的目的在于探讨SUMO化相关基因在肿瘤细胞中双微体产生及稳定存在方面的作用，以及对含双微体细胞生物学功能的影响。明确SUMO化相关基因UBC9与肿瘤细胞中双微体稳定存在之间的关系。本研究首先应用Real-Time PCR检测含双微体的UACC-1598-4/-59和COLO320DM/320HSR细胞模型中12个SUMO化相关基因的表达水平，之后结合Western blot结果，最终确定把UBC9基因做为实验的目的基因。选取双微体数目较稳定的UACC-1598-4和COLO320DM细胞做为研究对象。利用RNAi技术干扰UBC9基因的表达，从蛋白水平检测基因沉默效果，制备中期染色体核型检测双微体数目变化。利用Real-Time PCR检测双微体携带基因扩增情况，荧光原位杂交技术（FISH）检测双微体携带基因的扩增情况以及微核产生情况，同时利用免疫荧光（IF）和Western blot技术检测DNA损伤情况。在细胞生物学功能方面主要利用MTS和平板克隆的方法检测细胞增殖能力，再应用基底膜侵袭实验的方法检测细胞的侵袭能力。在肿瘤细胞中沉默UBC9基因后，引起双微体数目减少，双微体上携带基因扩增水平降低，减少的双微体以微核的形式排出胞外，并且导致细胞增殖能力和侵袭能力降低。利用生物信息学软件对TCGA数据库UBC9表达与肿瘤中表达情况的研究，进一步揭示针对UBC9靶向治疗的可能意义。通过实验结果我们发现，SUMO化相关基因UBC9基因在双微体的产生和稳定性的维持方面发挥着一定的作用，并影响双微体肿瘤细胞的生物学功能，在双微体的形成过程中，SUMO化靶蛋白Ku70可能与双微体的形成有关。 本研究的结果为针对含双微体的恶性肿瘤细胞的生物治疗提供了新的靶向性治疗方案。利用UBC9特异性的反义核苷酸序列，通过RNAi干扰的方法减少UBC9的表达，减少双微体数目，降低肿瘤细胞的恶性程度，从而有效抑制恶性肿瘤细胞生长。