小峰熊蜂Bombus hypocrita蜂毒功能基因的筛选及特性研究

熊蜂蜂毒作为重要的蜂毒素具有多种药理和生物学活性，但作为全世界熊蜂资源最丰富的国家，我们对熊蜂蜂毒的研究还非常缺乏。本研究以我国人工饲养的小峰熊蜂为材料，对不同时期毒液成分差异进行分析，通过熊蜂毒腺cDNA文库的构建，试图找出熊蜂蜂毒主要蛋白成分的特有基因，并研究其特性。研究内容主要包括：1、不同时期的熊蜂毒液成分差异分析，用质谱方法鉴定双向电泳获得的蜂毒蛋白。2、构建熊蜂毒腺cDNA文库。对文库克隆进行批量测序，确定毒腺cDNA表达序列标签（ESTs），并对ESTs序列进行分析。3、对熊蜂蜂毒主要蛋白基因的克隆与分析。利用已知蜂毒蛋白及核酸序列，结合ESTs分析获得的蜂毒成分相关基因序列，设计引物对编码基因cDNA序列进行克隆及表达分析。4、熊蜂蜂毒主要蛋白基因转录和表达时相研究。利用Real-time PCR研究转录表达差异。用ELISA和Western分析蛋白表达差异。

蜂毒是古今中外广泛应用的天然药物，具有多种生物学活性，临床应用价值很高。我国具有丰富的熊蜂资源，开展熊蜂蜂毒的重要组成成份、生物学特性等方面的研究具有重要的意义。本项目利用分子生物学和生物信息学方法研究了小峰熊蜂蜂毒相关的基因，获得如下结果：（1）应用RNA-seq测序方法，获得工蜂10日龄和20日龄毒腺的转录差异表达基因，相对于10日龄，20日龄的工蜂有105基因上调，120个基因下调；（2）蜂毒PLA2基因的克隆与表达特性分析。结果表明：该基因全长为2 272 bp，GenBank登录号为KF214771，由4个外显子和3个内含子组成，编码区（CDS）长为543 bp，共编码180个氨基酸残基，含10个保守的半胱氨酸残基、1个保守的Ca2+结合位点和1个酶活性中心。荧光定量PCR结果表明，PLA2基因在小峰熊蜂各日龄均有表达，且随日龄增长，表达量呈先上升后下降的趋势，10日龄时出现峰值，其表达量显著高于其他日龄（P<0.05）。半定量PCR结果表明，PLA2基因在毒腺、卵巢、中肠中表达量较高，在足、触角、食道腺中表达量较低，在脂肪体、肌肉、神经、气管、复眼、脑中未表达；（3）获得小峰熊蜂酸性磷酸酶基因cDNA序列长度为2361bp，编码区长度为1317bp，氨基酸长度为439个，推测的分子量为50.23kD，等电点为8.2489，与B.impatiens熊蜂序列相似性最高，序列的一致性达到98%，具有一跨膜区，氨基酸序列位置为39-66个残基位。基于最大似然法（ML）构建的系统发育树表明，该基因存在两个不同异构体，不同的异构体之间熊蜂的序列都聚在一起，支持率达到100%，熊蜂与蜜蜂之间的亲缘关系相对于其它昆虫其遗传距离较近；（4）克隆获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列长度为1298bp，编码区长度为1128bp，编码的氨基酸379个，推测的分子量为41.115kD，等电点为6.982，与B. terrestris熊蜂丝氨酸蛋白酶序列相似性最高，序列的一致性达到99%，Western印迹显示，小峰熊蜂丝氨酸蛋白表达产物免疫兔子后，制备的抗体可以有效检测到抗原和熊蜂体内的抗原，丝氨酸蛋白大小约为40kD，多克隆抗体1：1000倍稀释，能有效的起免疫结合反应。本项目的完成，为熊蜂蜂毒的研究奠定重要基础，为蜂毒的人类利用研究提供了理论依据。