朱砂叶螨钠离子通道基因kdr突变的分子调控途径

昆虫等节肢动物对拟除虫菊酯类药剂产生kdr抗性的分子机制是钠离子通道基因产生了kdr突变，但人们对节肢动物kdr突变产生的分子途径以及有关重要农业害螨的kdr突变信息还不清楚。本项目在发现朱砂叶螨钠离子通道基因存在kdr突变（如F1538I）基础上，以室内维持的朱砂叶螨敏感和甲氰菊酯抗性品系为研究对象，分离纯化RNA和DNA；克隆钠离子通道基因cDNA和DNA全长；比较敏感、抗性品系钠离子通道基因核酸序列，鉴定与抗性有关的 kdr突变，建立朱砂叶螨kdr突变分子标记；分析kdr突变基因型分别在DNA和RNA水平与不同抗性表现型的相关性。将RNA编辑调控机制引入昆虫抗药性研究领域，阐明朱砂叶螨kdr突变表达调控的分子途径。研究结果对于阐明昆虫、螨类kdr突变分子调控机理，发展kdr抗性早期分子监测技术，制订kdr抗性管理措施和提供新的kdr抗性研究思路等均具有重要理论意义和实践价值。

甲氰菊酯是一种高效、低毒的拟除虫菊酯类杀虫、杀螨剂，可有效防治重要农业害螨-朱砂叶螨。拟除虫菊酯药剂的作用特点及叶螨的生物学特性极易导致朱砂叶螨对甲氰菊酯产生高水平抗性。节肢动物钠离子通道基因的核苷酸突变引起的氨基酸替代，可导致昆虫、螨类对拟除虫菊酯类药剂产生靶标抗性，即kdr（knock down resistance）抗性，而kdr抗性一旦产生，将导致同类药剂的防效失败。因此，kdr抗性突变的鉴定与快速检测，对于拟除虫菊酯药剂的抗药性治理意义重大。.本项目通过RACE技术克隆了朱砂叶螨钠离子通道基因cDNA全长（GenBank登录号：JQ290514）：开放阅读框含有6579个核苷酸，编码2193个氨基酸，涵盖钠离子通道基因的C-端、N-端及结构域ⅠS1-ⅣS6；比对朱砂叶螨SS（敏感）和FeR（甲氰菊酯抗性）品系的钠离子通道cDNA序列，发现在FeR品系有且只有一个突变位点，即F1538I突变。设计特异引物分别扩增朱砂叶螨SS及FeR品系钠离子通道基因组DNA片段，从DNA分子中也鉴定出F1538I突变，表明朱砂叶螨FeR品系钠离子通道基因存在的苯丙氨酸F-异亮氨酸I的突变是由于DNA突变转录导致，而不是由RNA编辑引起。使用高浓度甲氰菊酯（LC90, 约10000mg/L）处理朱砂叶螨SS品系,在死亡个体、存活个体及FeR品系中检测F1538I突变频率，结果为：在死亡个体、存活个体和FeR个体中，突变频率分别为0%、6.7%和100%。突变检测的实验结果表明，kdr突变F1538I在朱砂叶螨敏感种群中以较低频率存在（6.7%×10%= 0.67%），经甲氰菊酯筛选后以极高频率出现在甲氰菊酯抗性品系中，因此，F1538I突变与甲氰菊酯抗性密切相关，该突变可以作为朱砂叶螨对甲氰菊酯产生kdr抗性的一个分子标记位点。采用建立的分子检测方法对朱砂叶螨7个野外地理种群的kdr突变频率及其对甲氰菊酯的抗性水平进行监测，结果表明不同野外地理种群的F1538I突变频率与它们对甲氰菊酯不同抗性水平之间存在正相关关系（R2=0.665）：地理种群的抗性倍数从3.8 增加到 16.2，相应的突变频率从13.6%增加至45%，实际验证了朱砂叶螨基因的F1538I突变可以作为其对甲氰菊酯产生kdr抗性的分子标记。