AVMs与朱砂叶螨受体-氯离子通道的互做机制研究

Avermectins act on GABA receptors (GABARs) or inhibitory glutamate receptors (IGluRs) in vertebrate and many Ecdysozoa, which cost about half a century to clarifying, but two questions remain unclear. The one is that the definite target for avermectin b1a (AVM) in mites is far from clear although AVM is an extremely active acaricide, the other is that ivermectin (IVM) and AVM are analogues with very similar chemical structure but their bio-activity differs and the reason is ambiguous. In this project, the full length cDNA for GABARs and IGluRs would be cloned from Tetranychus cinnabarinus and their cRNA would be injected into Xenopus oocytes with that of report gene for obtaining channel protein and toxicology functional study, respectively. Single cell patch clamp technique would be adopted recording the produce and changes of the membrane current after AVM and IVM acted on different subunits of GABARs and IGluRs, respectively. The influence on GABA- or Glu-induced membrane current and concentration-response curve would be analyzed, from which the molecular target for AVM in T. cinnabarinus would be identified. The sequences of molecular target for AVM would be compared between the susceptible and AVM-resistant T. cinnabarinus, then identify the AVM-resistance related point mutation and its mutant function. From all the above, we could systematically illustrate the acaricidal target for AVM and the reasons why AVM and IVM differ in bio-activity with similar chemical structure.

研究表明阿维菌素类药剂（AVMs）作用于脊椎动物和蜕皮动物的γ-氨基丁酸受体（GABARs）或抑制性谷氨酸受体（IGluRs），但至今阿维菌素(AVM)作为优异杀螨剂的作用靶标并不清楚。本项目拟克隆获得朱砂叶螨GABARs和IGluRs基因cDNA全长；构建报告基因-受体基因融合表达载体并在爪蟾卵母细胞中表达受体蛋白；单细胞膜片钳记录分析系统鉴别表达蛋白的受体-通道性质及受体亚基类型，明确AVM分别对GABARs和IGluRs不同亚基刺激后膜电流的产生、变化情况，分析AVM对GABA或Glu诱导电流的影响并建立浓度-效应关系，据此鉴定AVM杀螨作用的分子靶标。

阿维菌素类药剂是一种具有良好活性的杀虫、杀螨和杀线虫剂，目前被广泛用于农业害虫以及卫生害虫的防治。阿维菌素类杀虫剂的毒理学机制和害虫对其的抗性机制研究是杀虫剂毒理学的热点之一，但在叶螨中的研究目前仍然十分缺乏。因此，本项目以两个方面为研究目标：①明确AVM对害螨（以朱砂叶螨为代表）作用的具体分子靶标; ②比较AVM和IVM与朱砂叶螨GABARs和IGluRs互作，阐明二者的活性差异是与作用靶标改变有关还是与作用靶标未变但与靶标作用性质改变有关，进行了朱砂叶螨阿维菌素分子靶标鉴定的系统研究，取得了以下研究成果：. 1. 朱砂叶螨谷氨酸氯离子通道，γ-氨基丁酸氯离子通道基因克隆及其表达模式分析. 从朱砂叶螨转录组中获得了5条谷氨酸氯离子通道（GluCls）及3条γ-氨基丁酸氯离子通道(GABACls)基因序列，设计特异引物克隆获得了这8条基因cDNA全长。采用定量PCR技术解析8条氯离子通道基因在朱砂叶螨不同发育阶段的表达模式，结果显示所有基因在卵期的表达量相对最低，在其它螨态之间也略有差异。. 2. 朱砂叶螨氯离子通道基因在爪蟾卵母细胞中的表达. 使用爪蟾卵母细胞表达系统成功表达了5条GluCls和3条GABACls基因。在特异性神经递质（谷氨酸或GABA）的刺激下，卵母细胞出现内向电流，据此明确了基因编码通道蛋白的生理功能。. 3. 阿维菌素杀螨作用分子靶标的鉴定. 通过RNAi技术沉默朱砂叶螨5条GluCls基因后，朱砂叶螨对阿维菌素的敏感性下降；同样地，沉默3条GABACls基因后，朱砂叶螨对阿维菌素的敏感性也下降。而电生理学研究表明5条GluCls对阿维菌素和伊维菌素均敏感， 3条GABACls对阿维菌素和伊维菌素均不敏感。综合电生理研究和RNAi结果表明：朱砂叶螨GluCls为阿维菌素和伊维菌素的主要分子靶标，GABACls可能是其作用的次要分子靶标。. 4. 朱砂叶螨靶标抗性机制分析. 定量PCR技术检测发现8条氯离子通道基因的mRNA表达量在朱砂叶螨敏感及阿维菌素抗性品系中没有显著差异，序列比对分析发现8条基因在朱砂叶螨敏感及阿维菌素抗性品系间不存在氨基酸水平突变。表明在目前抗性水平下，朱砂叶螨对阿维菌素的抗性不涉及这些通道基因的变化。