朱砂叶螨几丁质代谢关键基因鉴定及其功能研究

Tetranychus cinnabarinus (Boisduval) (Acari: Tetranychidae) is an important and worldwide pest mite in agriculture which has many hosts, that devastates economic crops and ornamental plants. And it has developed severe resistances to most of insecticides and acaricides. Therefore, it is very important to find a new method to control T. cinnabarinus. In insects (mites), chitin plays a significant role in the physical progress of growth and development, Chitin synthase and chitinase are the key enzymes in the pathway of chitin metabolism and the ideal targets for designing eco-friendly insecticides. Pest control by interfering and disrupting chitin metabolism demonstrate potential roles in researching on novel pesticides and integrated pest management. Taking T. cinnabarinus as research object, we will firstly clone the chitin synthase and chitinase genes from T. cinnabarinus and analyze the sequences with bioinformatics methods, then explore the mRNA expression patterns, prokaryotic expression and functions of chitin synthase and chitinase genes from T. cinnabarinus. Combining with the conclusions, this study will make a comprehensive analysis on the function of chitin metabolism during the growth and development of T. cinnabarinus, and it is expected to be helpful for designing new and special pesticides and pest management basing on the chitin metabolism.

朱砂叶螨是一种世界性害螨，寄主广泛，是各种经济作物和观赏植物的最主要害虫，造成严重的经济损失；已经发现其对多种杀虫剂抗性发展迅速。因此，寻找新的途径防治朱砂叶螨尤为重要。几丁质在昆虫（螨）的正常生长发育过程中至关重要，而几丁质合成酶和几丁质酶是参与几丁质合成和分解代谢的关键酶；通过干扰和破坏几丁质的代谢进行害虫防治，在新农药研发和害虫控制方面潜力巨大。本研究围绕朱砂叶螨生长发育过程中几丁质合成和分解代谢这一科学问题，在克隆朱砂叶螨几丁质合成酶和几丁质酶基因cDNA全长序列并进行生物信息学分析的基础上，进一步探讨其mRNA表达模式以及基因的异源表达和重组蛋白的研究，验证基因在蜕皮中的作用。该项目结果将为研究几丁质代谢在朱砂叶螨生长发育过程中的作用提供重要信息，为基于几丁质代谢路径来寻找新的特异性的药剂作用靶标来控制朱砂叶螨提供重要的理论依据。

朱砂叶螨是一种世界性害螨，是各种经济作物和观赏植物的最主要害虫，造成严重的经济损失。几丁质合成酶和几丁质酶是参与几丁质合成和分解代谢的关键酶，其编码的基因的鉴定将加速昆虫表皮发育的研究，为基于表皮的害虫防控提供新的分子靶标。本研究明确苯甲酰基脲类杀虫剂除虫脲对朱砂叶螨不同螨态的生长发育及繁殖产生影响，且毒力大小为：卵>幼螨>若螨>雌成螨；亚致死剂量杀虫剂分别处理不同螨态后，发现均产生氧化胁迫，机体启动自身的保护酶系（SOD、CAT和POD）和解毒酶GSTs来对药剂胁迫作出生理性响应。朱砂叶螨几丁质合成酶基因TcCHS1全长为4881 bp，4425 bp的开放阅读框（编码1474个氨基酸），该基因编码的氨基酸有17个跨膜螺旋（典型的跨膜蛋白）；几丁质酶基因TcCht8和TcCht9基因各编码397和410个氨基酸，都属亲水性蛋白；TcCHT9含有信号肽；TcCht8具有一个跨膜结构域。TcCHS1、TcCht8和TcCht9在朱砂叶螨的不同螨态（卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨）中均表达，TcCHS1在卵和雌成螨中的表达量较高，在第2若螨的表达量最低；TcCht8和TcCht9在成螨中的表达量较高，在卵和幼螨的表达量最低。不同浓度除虫脲分别处理朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨和雌成螨后的结果表明不同螨态朱砂叶螨体内TcCHS1基因的表达量均上调。利用限制性内切酶EcoRI和HindIII的双酶切以及重组DNA技术成功构建朱砂叶螨几丁质合成酶基因基于pET-32a(+) 的原核表达载体，并使用SDS-PAGE技术成功检测到目的蛋白（约35.66 KDa）的表达。采用高通量测序技术对朱砂叶螨暴露于DFB的响应的结果表明：与对照组相比，低和高浓度除虫脲处理组分别鉴定得到470个和49个DEGs。对解毒酶基因进行分析，共得到34个P450s、17个GSTs、12个AchEs和9个ABC转运蛋白基因。DEGs分析结果表明，与对照组相比，杀虫剂胁迫后，体内解毒酶基因表达普遍增强；几丁质代谢通路的关键基因表达上调。这些结果将为研究几丁质代谢在朱砂叶螨生长发育过程中的重要作用提供基础。