朱砂叶螨GSTs基因鉴定及其代谢功能分析

Glutathione S-transferases （GSTs）are functional superfamily.genes. They are important for the detoxification of pests, and involved in the motebolic processes. This study aims at the Tetranychus cinnabarinus, a major pest of fruits and vegetables, using molecular biology and biochemistry technology to fully sequence its GSTs genes, and analyze the gene characteristics; systematically apply qPCR to detect the expression profiles of GSTs genes among different strains, developmental stages,and acaricides treatments; establish the RNAi technology for T. cinnabarinus, and silence the imoprtant GSTs, which may worked in detoxification to show the sensitivity change to acaricides through bioassay;insect cell expression system is used to express GSTs, and the motebolic function of recombined proteins are detected. The results will clarify the effct of GSTs on the resistance of T. cinnabarinus from both gene and protein level.It will promote the understanding of resistance mechanism of T.cinnabarinus, and provide basic imformation for its resistance management.

谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是一类多功能家族酶，在害螨的解毒代谢中起着重要作用，广泛参与了和抗药性有关的代谢过程。因此，本研究以果蔬重要害螨朱砂叶螨为研究对象，通过分子生物学和生物化学等研究手段，大规模克隆朱砂叶螨GSTs基因，通过序列解析明确其分子生物学特征；利用qPCR的方法检测这些基因在不同螨态的基本表达特征以及对药剂刺激的应激表达模式；建立朱砂叶螨RNAi的技术体系，沉默可能在解毒代谢中起重要作用的基因，并通过生物测定分析基因沉默对抗药性变化的影响。同时利用昆虫细胞表达系统进行GSTs基因的异源表达，检测重组蛋白的代谢功能。最终从基因和蛋白质水平阐明GSTs对朱砂叶螨抗药性的影响，补充和完善朱砂叶螨抗性机制的研究，并为朱砂叶螨的抗性治理提供理论依据。

朱砂叶螨是我国蔬菜、棉花等重要经济作物上的主要害螨。该螨的防治多年来一直以施用化学农药为主，但是由于其具有世代周期短，繁殖能力强等特点，导致该螨的抗药性发展十分迅速。因此明确朱砂叶螨的抗性产生机制对开展有效的抗性治理具有重要意义。谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是一种多家族的解毒代谢酶，广泛参与了生物对各种有毒物质的代谢过程。本项目在朱砂叶螨转录组数据的基础上，利用PCR的方法扩增获得了13个GSTs基因的完整开放阅读框，通过序列分析以及构建基因系统发育树，发现其中5个基因属于GSTs的delta家族，8个基因属于GSTs的mu家族。比对分析发现它们的序列在朱砂叶螨对甲氰菊酯敏感、抗性品系间没有出现点突变现象，并且基因的表达也没有明显差异，但是经亚致死剂量的甲氰菊酯诱导后，有5个基因的表达量在抗性品系中出现了显著性上升，据此推测朱砂叶螨GSTs的可诱导性可能与其抗药性有关。在建立适用于朱砂叶螨的RNAi操作体系的基础上，以其中相对表达量最高的TcGSTM7基因为重点研究对象，利用饲喂法导入dsRNA干扰了TcGSTM7在朱砂叶螨体内的表达，定量检测表明沉默效率达到48%，随后进行生物测定发现，抑制TcGSTM7的表达后朱砂叶螨对甲氰菊酯的敏感性显著上升，进一步证明TcGSTM7的表达与朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗性相关。在蛋白水平通过构建TcGSTM7编码蛋白的三维结构模型，利用原核表达技术成功获得了TcGSTM7重组蛋白。对分离纯化后的重组蛋白进行酶活检测，结果显示该蛋白具有GSTs的催化活性，且酶活抑制实验结果表明该活性可被甲氰菊酯抑制。以上结果均证明TcGSTM7在朱砂叶螨对甲氰菊酯的代谢过程中起作用。同时，本研究基于饲喂法建立了适用于叶螨的RNAi技术体系，为围绕RNAi开发新型叶螨防控技术奠定了基础，将TcGSTM7作为RNAi的靶标可缓减朱砂叶螨对甲氰菊酯抗药性的产生。