刺槐杂交结实率低的机理研究

多年研究发现刺槐杂交中去雄操作造成结实率大幅度降低，他人试验也证明了同样的结论，但该难题至今还未攻克，其机理尚未阐明，极大地限制了刺槐乃至蝶形花科其他植物的杂交育种进程。在前期研究中，我们发现去雄会促使花产生大量乙烯并引起脱落酸含量上升，推测去雄杂交使得花发育、授粉受精、子房发育过程中基因调控和蛋白表达发生了变化并引起相关的生理调节物质及其信号传导系统改变，加速了花的程序性死亡和衰老脱落，进而影响和阻滞了授粉受精以及子房的正常发育进程，导致结实率降低。为探究其机理，将利用气质联用法、cDNA-AFLP法、TUNEL和DNA梯度电泳法测定花（全花、子房）发育过程中激素含量、基因表达和细胞程序性死亡的变化情况，利用透射电镜观察授粉受精过程中花柱内信号物质（钙、自由生长素、甲酯化果胶）存在状态和位置的改变，从而揭示去雄导致杂交结实率低的机理，为提高刺槐乃至其它雌雄同花植物的杂交结实率奠定基础。

在国家自然基金项目“刺槐杂交结实率低的机理研究”资助下取得新进展。刺槐雌雄蕊同熟，单花花粉量高达28072±879，花粉胚珠比(P/O)高于1000，雌蕊可授期4d，刺槐OCI（杂交指数）为4，即刺槐交配系统为部分自交亲和，异交需要传粉者。利用焦锑酸钙沉淀法分析刺槐去雄后柱头和花柱内钙离子分布对花粉萌发和花粉管生长的诱导作用，去雄影响柱头和花柱内钙离子等信号物质存在和分布状态，对花粉管生长和受精作用产生不利影响。利用气相色谱仪、气质联用仪和紫外分光光度仪测定去雄对刺槐花激素和同化物含量影响，去雄使花中ABA（脱落酸）含量显著升高，花中乙烯释放量增加，花中JA（茉莉酸）和还原糖含量明显下降。利用cDNA-AFLP法分析去雄引起的伤害响应对刺槐花基因表达的影响，去雄响应使与代谢、生长调控、信号传导、光合作用等相关基因表达量下调，使胁迫响应、促进衰老相关的基因表达量上调，并测序73个基因片段。去雄加速花的衰老脱落，使子房跟随花冠过早脱落，导致人工杂交坐果率降低。以刺槐不同单株、不同器官为研究材料，利用实时荧光定量PCR技术对前期研究中获得的刺槐去雄伤害响应基因的cDNA-AFLP差异表达结果进行重复验证，并对6种刺槐内参基因表达稳定性进行了研究，找到刺槐real-time PCR内参基因，随机选取8个片段(TDF)进行Real-time PCR的荧光定量验证与分析，发现验证结果与cDNA-AFLP的结果一致。以遗传背景不同的刺槐样株的不同器官组织为材料，等量混合后进行转录组测序和分析，利用所得数据筛选SSR和SNP标记位点，研发刺槐SSR父本鉴定和分析技术。研究刺槐、金叶刺槐、红花刺槐、四倍体刺槐和香花槐的花粉活力、柱头可授性、杂交可配性等不同类型刺槐杂交可配性，发现只有刺槐做母本时，与红花刺槐、金叶刺槐和四倍体刺槐做父本的杂交可获得杂种和杂种苗。建立刺槐杂交体系进行刺槐控制授粉、自由授粉和混合控制授粉（花粉竞争）试验体系，综合利用人工控制授粉、荧光显微观察、及SSR父本分析技术，对刺槐开花动态、刺槐有性生殖过程中胚珠（种子）成熟及败育规律及交配机制进行系统深入研究，搞清楚了刺槐交配过程中的花粉竞争及子代选择机制，提出了刺槐不去雄进行杂交育种的新策略，以及解决刺槐去雄杂交座果率低问题的对策和方法。综上所述，本研究超额完成了原计划中的任务指标。