猪瘟病毒RNA在体内外感染细胞中的复制动态研究

The distribution dynamics of CSFV RNA in infected cells is very important to elaborate the replication rule of CSFV, which is very weak in this field nowadays. To define target cell types after CSFV acute and chronic infection and the replication dynamics of CSFV infected cells, a novel QuantiGene ViewRNA CSFV RNA in situ hybridization method is estabished to study the RNA replicattion dynamics of CSFV in target cells in vitro. The infected cells from organs of CSFV acute and chronic infection pigs would be detected sensitively and visualized by method mentioned above in order to study the replication and distribution dynamics of CSFV RNA in infected cells. The association between CSFV RNA replication and distribution dynamic, pathogenesis and pathological lesion will be discovered combined with cell biological and pathological results and difference between different target cell types after CSFV acute and chronic infection will be difined. These findings provide useful insights into CSFV RNA replication and guidance for the CSFV sampling in clinical case.

CSFV RNA在感染细胞中的分布动态研究对于阐明其复制规律具有重要意义，目前该领域研究尚处于薄弱环节。为研究CSFV RNA在体内外感染细胞中的复制动态并界定急性、慢性感染后靶细胞类型。本研究拟采用QuantiGene ViewRNA 原位杂交技术，研究CSFV RNA在易感细胞中的复制规律；建立急性、慢性感染动物模型，使用上述技术对急性、慢性感染后各器官靶细胞中CSFV RNA进行精确定位，对病毒RNA复制和分布的动态进行高敏感可视化研究。探索急性、慢性CSFV感染靶细胞类型的差异，结合细胞生物学及病理学研究结果，分析CSFV RNA复制动态、分布变化与病程、病理损伤之间的相关性。旨在阐明CSFV感染过程中病毒RNA的复制规律，同时对明确CSFV RNA富集样品的临床采集提出指导意见。

猪瘟是由CSFV引起的猪的高度接触性、致死性传染病，在我国长期存在并呈持续感染现状，对CSF的根除产生严重影响。研究CSFV RNA在感染细胞中的分布动态对阐明其复制规律具有重要科学意义，常规方法灵敏性低；定量Real-time PCR法无法对单个RNA分子进行定位和复制动态研究。ViewRNA ISH技术是基于传统技术发展起来的新型RNA原位杂交技术，可用于单细胞中单RNA分子的定位检测。通过该方法阐明了CSFV体内外感染过程中RNA在靶细胞中的定位、复制动态，从RNA分子角度阐明CSFV致病机理，也对临床采集CSFV RNA富集样品提出了指导意见，建立了敏感特异的新型诊断方法。本项目超额完成了计划任务，达到了预期目标。. 首次建立了对病毒RNA进行细胞内定位的CSFV可视化原位杂交技术（CSFV ViewRNA ISH），灵敏度高、特异性强和稳定。应用该技术研究了CSFV强致病力SM株、中等致病力HeBHH1/95株和疫苗株在体外细胞感染过程中RNA动态分布规律，在感染早期0.5hpi即可在胞核与胞浆内检测到RNA，第一次发现了CSFV RNA有在细胞核内的生活史；也为猪瘟疫苗生产中病毒培养提供数据支持。. 在人工构建的猪瘟急性和亚急性动物模型上，采用该方法进行了感染组织中RNA分布定位研究，以免疫组化、HE染色法验证其与组织损伤程度的相关性。从而全面系统的从临床症候学、分子病理学、RNA水平、病毒粒子角度比较研究了CSFV RNA的分布规律与嗜性，阐明了急性与亚急性感染病理病程与RNA分布和组织嗜性具有正相关，也为其它病毒病的致病机理研究奠定重要的基础。. 本项目还建立了适用于临床诊断的《猪瘟病毒核酸杂交检测试剂盒》，具有特异性强、敏感性高、重复性好和省时的优点，与常规方法相比可实现对病毒RNA的精确定位和定量检测，为我国猪瘟的防控提供了重要技术手段。