外被体蛋白Ⅰ在猪瘟病毒细胞内转运和复制中的作用及机制

Intracellular coatmer proteinⅠ(COPⅠ) mediate the protein retrograde transport of Golgi-to-ER and are involved in viral repliction. Our previous studies showed that the COPⅠhave closely relationship with the replication of classical swine fever virus (CSFV). However, the mechanism remains unclear. Based on our previous study, this study will investigate the expression and location relationship between COPⅠand CSFV structural and non- structural proteins. By real-time PCR, Western blot and immunofluorescence, the characteristic of CSFV intracellular transport will be explored. In addition, the siRNA and lentivirus will be used to change the expression of COPⅠproteins and the key proteins which has significance effect on CSFV replication will be make certain. Furthermore, the composition of COPⅠ-CSFV transport complex and their interaction pattern will be studied by Co-IP, GST pull-down and laser scanning confocal microscope. This study could deepen our understanding of CSFV intracellular transport and replication mechanisms. In conclusion, our study will provide new scientific data for elucidating the mechanism of CSFV infection.

宿主细胞的外被体蛋白Ⅰ（coatmer proteinⅠ，COPⅠ）介导高尔基体-内质网的逆向运输，参与了多种病毒的转运与复制过程。我们研究发现COPⅠ对猪瘟病毒（CSFV）的复制有显著影响，但其作用机制还不清楚。本项目拟在前期研究基础上，用real-time PCR、Western blot、免疫荧光等技术，分析CSFV结构蛋白和非结构蛋白与COPⅠ之间的表达量及胞内定位的关系，明确COPⅠ介导CSFV胞内转运的方式；通过siRNA技术和慢病毒过表达技术，检测细胞内COPⅠ蛋白表达量的变化对CSFV复制的影响，进而确定调控CSFV复制的关键蛋白；通过激光共聚焦、Co-IP、GST pull-down等技术，分析COPⅠ转运CSFV的复合体组成及互作模式，进而揭示COPⅠ调控CSFV在宿主细胞内的转运和复制的机制，为阐明CSFV建立感染的机制提供新的科学资料。

外被体蛋白Ⅰ（coatmer proteinⅠ，COPⅠ）是细胞内的一种蛋白复合物，由9个亚基组成。COPⅠ在出芽小泡的胞质溶胶面聚合，形成COPⅠ包被囊泡，介导高尔基体-内质网（Golgi-ER）的逆向转运功能。一些病毒能够利用宿主细胞COPⅠ包被囊泡介导的转运途径，完成自身组分的胞内转运和复制。本项目旨在通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光等分子生物学手段，分析猪瘟病毒（CSFV）感染与COPⅠ之间的表达及胞内定位的关系，明确COPⅠ介导CSFV胞内转运的方式；用过表达或敲低目的蛋白检测COPⅠ及关键调控蛋白表达量的变化对CSFV增殖的影响，进而探明COPⅠ调控CSFV复制的机制。结果表明，CSFV感染会显著上调组成COPⅠ各亚基的表达，通过分离CSFV感染前后宿主细胞内源性的COPⅠ包被囊泡，并对其进行蛋白组学检测，发现CSFV感染可以改变囊泡中转运物质的成分及含量，证明CSFV感染调控COPⅠ包被囊泡的转运功能；通过改变胞内COPⅠ及调控其囊泡组装的关键蛋白Rab1b、高尔基体布雷菲德菌素A抗性因子1（GBF1）、ARF-GTPase激活蛋白1（ARFGAP1）、ADP-核糖基化因子（ARFs）的表达，发现COPⅠ及其调控蛋白均参与CSFV的胞内转运与增殖过程，其中关键调控蛋白ARF1以GBF1 Sec7结构域依赖的形式激活COPⅠ包被囊泡的组装，进而促进COPⅠ包被囊泡通过晚期内体途径转运CSFV，参与CSFV的入胞；被GBF1 Sec7结构域激活的ARF1仍通过调节线粒体胆固醇转运促进CSFV增殖；关键调控蛋白ARFGAP1与CSFV NS5A蛋白相互作用，通过平衡CSFV诱导的内质网应激反应促进CSFV的增殖；证明COPⅠ包被囊泡系统介导的转运途径是CSFV增殖的重要宿主因子。此外，Rab18蛋白和Rab6a蛋白介导的非COPⅠ包被囊泡依赖型Golgi-ER逆向转运途径参与CSFV蛋白的胞内转运，其中Rab18蛋白调节CSFV NS5A蛋白的胞内转运，而Rab6a蛋白负责CSFV E2蛋白的胞内转运；囊泡转运调控蛋白Rab22a在CSFV增殖中发挥了重要作用。研究结果揭示了COPⅠ包被囊泡介导猪瘟病毒胞内转运的方式和影响病毒复制的机制，为深入理解猪瘟病毒感染建立过程和复制机制提供了科学资料。