外泌小体介导猪瘟病毒在细胞之间扩散的分子机制研究

Classical swine fever (CSF) is a highly contagious and devastating swine disease caused by CSF virus (CSFV). Currently it remains unclear how CSFV hijacks the host biosynthetic systems for the viral budding and dissemination. It was reported that the viral release and transmission systems of many viruses extensively converge with the exosomal biosynthetic and dissemination pathways, in which viral components or virion particles can be assembled into exosomes. Therefore, the viral modified exosomes can serve as a vehicle to mediate viral transmission through transferring viruses to the neighbouring cells or the distal cells in the host. In order to explore the role of exosome in CSFV dissemination, differential centrifugation and immunomagnetic capture were applied to purify the exosomes released by CSFV-infected cells, and the protein composition of exosomes was analyzed by LC-MS/MS. Determination of viral titration or genomic copies in exosome-incubated cells were conducted to detect if exosome can mediate transmission of CSFV between cells. RNA interference (RNAi), co-immunoprecipitation (Co-IP), fluorescence in situ hybridization (FISH) and Western blot were used to determine the mechanism of CSFV release by hijacking the exosomal biosynthetic system-endosomal sorting complex required for transport (ESCRT). This project will provide new insights into elucidation of the molecular mechanism of CSFV dissemination and lay the foundation for the development of novel vaccines and anti-viral drugs.

猪瘟是由猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）引起的严重危害全球养猪业的猪烈性传染病。然而，CSFV劫持哪些宿主细胞的生物合成与转运系统来进行病毒粒子的释放和扩散尚不清楚。研究发现，许多病毒能利用外泌小体（exosome）生物合成和扩散途径进行释放和扩散，病毒成分或粒子被包装到外泌小体后可通过其转运至邻近或机体远端细胞，从而促进病毒扩散与感染。为了探索外泌小体在CSFV扩散中的作用，本项目拟提纯CSFV感染细胞产生的外泌小体，质谱和细胞感染实验鉴定外泌小体的蛋白质组成及其介导病毒粒子在细胞之间的扩散；利用RNA干扰、免疫共沉淀、荧光原位杂交和Western blot等技术研究CSFV劫持外泌小体生物合成系统ESCRT进行病毒粒子释放的机制。本研究有望从新的角度解析CSFV释放和扩散的分子机制，从而为新型疫苗和抗病毒药物的研发提供理论指导。

猪瘟是由猪瘟病毒引起的严重危害我国养猪业的重大传染病之一，猪瘟病毒以何种形式存在尚不明确。为了探索外泌小体在猪瘟病毒扩散和感染中的作用，将猪瘟病毒基因2.1c亚亚型毒株GD53/2011株接种至ST细胞，利用差速离心和外泌小体分离试剂初步分离外泌小体（GD53-外泌小体），然后进行碘克沙醇密度梯度离心以进一步提纯。GD53-外泌小体呈圆形，直径约为30-80 nm，其含有外泌小体标志蛋白TSG101和ALIX，但不含病毒蛋白Core和Npro蛋白。TCID50测定发现，不同密度层的样品均含有感染性的粒子，但外泌小体标志蛋白含量最高的密度层病毒滴度最高，表明纯化的GD53-外泌小体具有感染能力。LC-MS/MS分析发现纯化的GD53-外泌小体含有96个蛋白质，包括病毒蛋白Erns，外泌小体标志蛋白、骨架蛋白、细胞粘附分子、伴侣蛋白和蛋白酶等。siRNA介导的ALIX和HRS表达下调抑制猪瘟病毒的复制与释放。与此同时，实验构建了仅含猪瘟非结构蛋白的亚基因组复制子（GD53-SGR），其体外转录获得的RNA转染ST细胞后，经加压筛选获得了SGR稳定复制的细胞系。提取SGR细胞系产生的外泌小体（SGR-外泌小体）与正常ST细胞孵育，SGR-外泌小体和GD53-外泌小体感染新的ST细胞后均能在细胞中复制，表明外泌小体能介导猪瘟病毒在ST细胞之间的扩散和感染。为了进一步研究猪瘟病毒Erns蛋白的释放形式，实验构建了表达含有和不含信号肽的C株Erns蛋白的ST-C-ΔErns和ST-C-Erns细胞系，结果发现ST-C-Erns细胞系培养上清中的荧光强度显著高于ST-C-ΔErns细胞系，表明信号肽能调节Erns蛋白的释放。通过对从ST-C-ΔErns和ST-C-Erns细胞系培养上清中的外泌小体进行分析发现，ST-C-Erns细胞系提取的外泌小体中含有Erns-EGFP蛋白和外泌小体标志蛋白ALIX和TSG101，初步推测Erns蛋白可能以外泌小体形式分泌至胞外。此外，项目还对猪瘟病毒石门强毒感染猪的血清代谢组学进行了研究。与正常猪相比，在感染猪血清中发现有86个差异代谢物，其中47个代谢物表达下调。与这些差异代谢物相关的代谢通路包括色氨酸/犬尿氨酸通路、脂肪酸合成与β-氧化、支链氨基酸代谢和三羧酸循环等。上述研究成果有助于进一步揭示猪瘟病毒的感染与致病机制。