西南地区快速流行基因型- - 6型HCV病毒培养体系构建及其感染与增殖特性研究

The virus culture system is a useful technique platform for analyzing viral infectivity and replication, for development of drugs and vaccine. Phylogenetically, HCV has been classified into at least six genotypes and more than eighty subtypes. The characters of virus transmission, disease progression and treatment response were different between various HCV genotypes. It is necessary to develop the culture system of various genotypes, particularly the emerging or fast spreading genotypes. Based on our previous finding of multiple HCV genotypes prevalence in Yunnan, in this study, we are going to amplify the partial genome of 5' un-coding region and all structure proteins coding region of genotype 6 HCV strains, which is fast spreading in southern and west-southern China. This fragment will be further inserted into the skeleton of J6/JFH-1 plasmid to construct the recombinant vector. After its linearization and subsequent transfection to Huh7 cells, the culture system of chimeric virus will be established. Then, the infectivity and replication ability of produced chimeric virus will be further determined. In comparison with JFH-1 and J6/JFH-1 culture system, which derived from genotype 2a, the natural mutation sites were revers mutated to clarify the relationship between the virulence and gene mutation of structural protein. Through the conducting of this study, the chimeric HCV culture system of genotype 6, will be established, as a technique support for the research on HCV molecular virology and development of anti-HCV drug and vaccine. Furthermore, the results of this study will shed a light on the mechanism of genotypes 6 strains' wide prevalence in Southern and South-western China.

病毒体外培养体系是研究病毒感染能力、增殖速度等毒力特性，进行抗病毒药物筛选与疫苗开发的重要工具。根据基因组核酸变异而区分为多种基因型的丙型肝炎病毒，其传播特性、病程特点及药物治疗反应性也明显不同，有必要根据病毒主要流行基因型的变化，针对性建立病毒培养体系。本研究拟在前期研究已发现云南省多基因型HCV分布的基础上，选择扩增西南地区正在快速流行6型样本的5'非编码区-结构蛋白基因片段，与已建立的HCV病毒培养体系中的J6/JFH1质粒进行基因重组，构建正在快速流行HCV病毒株的嵌合体病毒培养体系，测定不同基因型嵌合体病毒间感染能力与增殖速度，通过交互回复突变及病毒毒力特性变化检测，阐明病毒核酸变异与其毒力变化的相关性。研究将建立西南地区6型HCV流行株嵌合体病毒体外培养体系，探讨6型HCV在西南地区快速传播的分子机制，为地区乃至全国丙型肝炎分子病毒学研究、抗病毒药物及疫苗研发提供技术支撑。

6 型 HCV 病毒具有较高基因型内病毒变异程度，是所有基因型中包含亚型种类最多的基因型。近年的诸多研究都表明，6型HCV在中国南、西南地区的流行呈现逐年上升的趋势。本研究拟在前期在云南发现命名了6u、6v亚型，并且发现6型特别是6u亚型的高度流行的基础上，通过Core-NS2基因替换J6/JFH1中对应基因，构建6型嵌合体重组病毒，获得6型HCV的高感染性克隆。在本项目的支持下，我们通过长片断PCR扩增、融合PCR、酶切等技术成功构建包括6型在内的7种基因型重组病毒质粒，并通过体外转录、电转等技术建立重组病毒培养体系。然而，对转染后病毒的载量测定和间接免疫荧光显示，除4型和7型以外，其他亚型重组病毒都成功转染细胞，但6u重组病毒在Huh7.5.1细胞中的增殖和其他亚型重组病毒一样，在细胞中呈现十分低下的感染和复制水平。随后本研究通过长时间的传代培养也未能获得具有高感染力的感染性克隆。本研究的研究结论证明了6型的高感染率和广泛的流行并不是由高度变异的Core-NS2基因单独决定的，可能和其余的基因相关。此外，在本课题的支持下，本研究还对“云南省HCV感染与人群的遗传背景的相关性”、“云南省HBV的基因型分析方法及基因型分布特征分析”、“云南省寨卡病毒输入性传播”以及“2013年云南部分地区流行登革的分子流行病学研究”等与本课题相关的方向开展了研究，为云南省丙型肝炎相关疾病的防治提供了科学依据。