卵巢组织玻璃化冷冻移植重建小鼠化疗后卵巢生育力的子代肿瘤易感性研究

Malignant tumor endangers human health severely. While chemotherapy possess antineoplastic properties through its cytotoxicity, it could do great damage to ovary, leading to premature ovarian failure (POF) and loss of fertility, which may reduce the female cancer survivors’ quality of life. Assisted Reproductive Technology help to rebuild ovarian function, playing an important role in the rehabilitation therapy of female cancer survivors. Our research group have figured that vitrification can provide better protection for the interstitial cells and extracellular matrix of ovarian tissue better in the preliminary study. We have also invented an even more efficient and safer vitrification method, and reconstruct the ovarian function of the chemotherapy-induced POF animal model successfully. However, it remains unclear that whether the offspring of this technology have received health risks. This research intends to rebuild the fertility of chemotherapy-induced POF mice model, screen out the filial generation mice by genetic features, and make a comparative evaluation of the expression and methylation status of imprinted genes (IGFR2/H19、M6P/IGF2R、SNRPN、PLAGL1) for the vital organs. In this matter we can make an evaluation of the vitrification offspring’s cancer susceptibility and safety, provide a research foundation to improve and optimize the fertility protection for the chemotherapy-induced ovarian injury.

恶性肿瘤严重危害人类的健康。化疗在发挥其细胞毒性抗肿瘤作用的同时造成卵巢损伤，导致女性患者卵巢早衰和生育力丧失，严重降低患者生存质量。运用辅助生育技术重建卵巢功能是女性肿瘤幸存者康复治疗的重要部分。本课题组的前期研究明确了通过玻璃化冷冻技术可以更好的保存卵巢组织；研创出一项更为高效安全的新型玻璃化冷冻方法；并运用该方法成功重建化疗后卵巢早衰动物模型的卵巢功能。但是，通过该方法所产生的后代是否存在健康风险尚不清楚。本项目在前期研究的基础上，建立化疗后卵巢早衰小鼠模型，通过该方法重建其生育能力，通过遗传学特征筛选出子代小鼠，对其重要脏器进行印记基因IGFR2/H19、M6P/IGF2R、SNRPN、PLAGL1甲基化状态和表达的对比研究，讨论后代肿瘤易感性问题。本课题作为评估卵巢玻璃化冷冻移植技术后代安全性的重要部分，可为改善和优化化疗后卵巢损伤女性的生育力保护技术体系提供研究基础。

研究背景及目的：.恶性肿瘤严重威胁人类健康，随着诊疗技术不断优化，患者预后得到明显改善，肿瘤幸存者明显增多。化疗的性腺毒性可造卵巢早衰及生育力丧失，严重影响女性肿瘤幸存者的生活功能和生存质量，威胁家庭和社会稳定。卵巢组织玻璃化冷冻移植技术可以重建化疗后卵巢功能，保存女性生育能力，临床意义重大。但该技术涉及体外操作和剧烈理化条件变化，目前尚不清楚其后代是否存在健康风险。.本次研究将建立化疗后卵巢早衰小鼠模型；通过卵巢组织冷冻移植技术重建其生育能力；通过遗传学特征筛选出移植卵巢所诞生子代小鼠，对其主要脏器组织进行肿瘤相关印记基因IGF2、H19、p73甲基化和表达情况检测；与正常妊娠小鼠子代进行对比分析，初步评估子代肿瘤易感风险。.材料与方法：.选择4周龄雌性C57BL/6J小鼠作为卵巢供体，使用NIV法玻璃化冷冻保存卵巢组织。.选择30只4周龄C57BL/6J-Tyrc-2J/J雌性小鼠，随机分为卵巢组织玻璃化冷冻移植组（V组）、新鲜卵巢组织移植组（F组）及对照组（正常妊娠，C组）。V、F组小鼠腹腔连续注射环磷酰胺建立化疗后卵巢早衰模型；C组小鼠腹腔注射生理盐水。成功建模的V、F组小鼠进行冻融或新鲜卵巢组织原位移植手术。.选择6-8周龄雄性C57BL/6J-Tyrc-2J/J小鼠与三组雌鼠合笼交配。V、F组选出由移植卵巢诞生的子代小鼠（黑色被毛），饲养至成年，观察生长发育情况；取得心脏、肝脏、肾脏组织进行印记基因IGF2、H19、p73甲基化状态和表达检测。.结果：.1.成功建立化疗后卵巢早衰小鼠模型；移植术后恢复良好；V、F组均有黑色被毛子代诞下。.2.子代小鼠未发现明显的出生缺陷和生长发育异常；其心脏、肝脏、肾脏大体观未见明显异常。.3. 在子代小鼠的心脏、肝脏组织中，V组的IGF2、H19、p73基因甲基化率与其相对表达量与F组C组均无显著差异（P >0.05）。但在肾脏组织中发现V组IGF2及H19基因表达显著上调（P=0.025，P=0.008）；而V组p73基因甲基化率显著降低（P=0.025）。.结论：.卵巢组织玻璃化冷冻移植技术可以重建化疗后卵巢生育能力，子代未见明显出生缺陷及生长发育异常；其心脏、肝脏组织肿瘤易感相关印记基因甲基化率和表达情况未见明显异常。但该技术可能对子代小鼠印记基因产生差异性影响，其子代的健康风险值得进一步研究。