转染乳腺癌相关HPV DNA序列诱导正常乳腺上皮细胞恶性转化的机制研究

Breast cancer is a kind of the women malignant tumor with high mortality and morbidity, but the mechanism behind still remains unclear. It has been recognized that HPV infection can cause cervical cancer. However, weather HPV infection can also cause breast cancer is not clear. Our previous study has found that HR-HPV infection also existed in fresh tissues of breast cancer specimens. We found koilocytes in about 40% of the infected mammalian tissue. Tissue microarray assay showed that HPV infection may lead to malignant transformation of cells by affecting P53 and P21 gene. This project aims to use molecular biology techniques such as HC2, PCR, and tissue microarray immunohistochemical staining to identify breast cancer related HR-HPV subtype in clinical mammalian specimens, including cloning and construction of recombinant retroviral vector carrying breast cancer related HR-HPV DNA sequence, MCF-10A infection of human normal mammary epithelial cells, confirming that the HR-HPV infection can cause morphological changes of mammary epithelial cells, produce koilocytes, promoting malignant transformation and clarifying its possible mechanism through genetic testing. The purpose of this study include: 1) Identification of HR-HPV subtype that can induce breast cancer. 2) Elucidating if HPV infection can lead to the occurrence of breast cancer and its molecular mechanism. 3) Provides new perspective for the prevention and treatment of breast cancer.

乳腺癌作为女性发病率最高的恶性肿瘤其病因尚未明确。HPV感染导致宫颈癌的发生已被公认，但其是否同样为乳腺癌的致病原因仍不明确。我们前期研究发现新鲜乳腺癌中组织存在HR-HPV的感染，40%的感染标本中可发现挖空细胞，组织芯片检测发现HPV感染可能通过影响P53及P21基因导致细胞恶性转化。本课题从临床入手，应用HC2、PCR及组织芯片免疫组化染色结合的技术在临床标本中筛选乳腺癌相关HR-HPV亚型。克隆并构建携带乳腺癌相关HR-HPV DNA序列的重组逆转录病毒载体，感染人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，证实乳腺癌相关HR-HPV能使乳腺上皮细胞出现形态学改变，产生挖空细胞，发生恶性转化，并通过基因检测探讨其可能发生的机制。本研究不仅筛选出可能导致乳腺癌发生的乳腺癌相关的HR-HPV亚型，同时还能为阐明HPV感染可导致乳腺癌发生及其分子机制奠定基础，为乳腺癌的预防和治疗提供新思路。

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤。HPV感染与乳腺癌的关系尚不明确。HC2法检测乳腺癌组织73 例（其中67例同时检测咽部HPV感染），乳腺良性病变组织 12 例，乳头溢液9例。乳腺癌组织和乳头溢液中均未检测到HPV感染。但7例乳腺癌患者检测到咽部HPV 感染，阳性率10.4%（7/67），说明咽部与乳腺组织不同时存在 HPV 感染，支持乳腺组织与人体其他部位不同时感染HPV的假说。1例导管扩张症组织中检出HPV 感染，阳性率8.3%（1/12）。对HPV阳性的8 例病变组织行P16和 Ki-67免疫组化染色，发现P16和Ki-67呈不同程度阳性表达。P16可能作为一个HPV感染的间接检测指标。. 利用高通量miRNA芯片从6例乳头溢液中（3例导管内乳头状瘤，3例导管内癌）筛选出表达有差异的miRNA， qRT-PCR验证miR-4484, miR-K12-5-5p, miR-3646在恶性乳头溢液中表达上调而miR-4732-5p表达下调。为miRNA作为一类新型乳头溢液肿瘤标志物做了探索性的研究。. Pdcd4在结肠癌和其他癌症中往往表达下调。敲除Pdcd4可以增加mTORC2活性，从而上调Snail的表达。通过对mTORC2成分的检测显示Pdcd4的下调会上调Sin1的蛋白表达水平而不影响mRNA的表达，这是由于Pdcd4增强Sin1翻译的缘故。荧光素酶报告基因试验中Pdcd4下调或敲除会显著增加Sin1 5’UTR-Luc的翻译但并不增加空载体的翻译，表明Sin1 5’UTR对于Pdcd4抑制Sin1的表达是必要的。过表达野生型Pdcd4和截短型Pdcd4（157-469）通过结合转录起始因子4A（eIF4A）充分抑制了Sin1的翻译，而突变型Pdcd4（157-469）（D253A-D418A）与eIF4A不结合，不能抑制Sin1的翻译且最终不能抑制mTORC2活性和结肠癌细胞的侵袭。silvestrol直接抑制eIF4A可以明显抑制Sin1的翻译并减小癌细胞侵袭性。这些这些结果表明Pdcd4-抑制Sin1翻译是通过影响eIF4A来显著抑制mTORC2活性和细胞侵袭性。在结直肠癌组织中，Pdcd4蛋白下调的同时Sin1蛋白明显上调，但mRNA水平无变化。总之：Pdcd4通过下调Sin1翻译来减弱mTORC2活性从而抑制侵袭。