转录因子介导的稻瘟病菌无毒基因AvrPik的表达调控机制研究

There are at least 5 AvrPik haplotypes (A-E) in rice blast fungus Magnaporthe oryzae, while only two promoter types (ⅠandⅡ) are present in regulating their expression. Our previous study identified an early-infection-stage induced transcription factor TF13894 specifically regulating the promoterⅠcoupled AvrPik-D expression, but not the promoterⅡcoupled AvrPik-A expression, which suggested the AvrPik expression could be precisely regulated by different types of promoter sequence. In this study, we aim to identify the TF13894 binding sequence in promoterⅠregion, interchange the AvrPik-A and AvrPik-D promoter, constitutively express TF13894 and mutate the TF13894 DNA binding domain to dissect how TF13894 regulate the AvrPik-D expression; Meanwhile, yeast one hybrid will be used to identify the transcription factor which could bind promoterⅡ, and the function and regulation mechanism of this transcription factor to control the promoterⅡcoupled AvrPik-A expression will be analyzed. Finally, we will analyze whether the transcription factors mutation in nature is a new avirulence variation mechanism of AvrPik field strain.

稻瘟病菌无毒基因AvrPik至少存在5个具有不同识别功能的亚型A-E，而其启动子只有Ⅰ和Ⅱ两个亚型。我们前期的研究发现，稻瘟病菌一个侵染早期表达的转录因子TF13894特异性地调控Ⅰ型启动子启动的AvrPik-D表达，而对Ⅱ型启动子启动的AvrPik-A没有调控作用，表明AvrPik可以通过启动子序列的差异实现其自身的精准调控。在此基础上，本研究拟通过鉴定Ⅰ型启动子区TF13894结合位点、AvrPik-D和AvrPik-A启动子互换、TF13894组成型表达以及TF13894自身DNA结合结构域突变等方案，详细阐明TF13894在AvrPik-D表达过程中的作用机制；同时，利用酵母单杂交鉴定结合Ⅱ型启动子的转录因子，分析该转录因子的功能及其如何调控Ⅱ型启动子启动的AvrPik-A表达；最后，分析自然条件下是否存在转录因子突变引起的田间AvrPik菌株毒性变异新机制。

稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻上的重大病害，病菌在侵染过程中分泌大量的致病因子（含效应蛋白）来克服寄主免疫防御以引起病害。然而，这一过程是如何调控的，尤其是在转录水平的调控，还知之甚少。 本研究前期从筛选侵染阶段特异表达的转录因子入手，从500个稻瘟菌转录因子中鉴定到30个转录因子在侵染阶段高度表达。本研究对其中5个转录因子的作用机制进行了深入解析。转录因子TF13894可以特异调控无毒基因AvrPik-D型的表达，而不调控AvrPik-A型的表达。这种调控特异性主要是通过TF13894结合AvrPik-D启动子（Ⅱ型启动子）区CACCCTGG基序实现的，而AvrPik-A启动子（Ⅰ型启动子）中该基序因发生突变不能被TF13894结合。同时，该基序对AvrPik-D的表达和对水稻Pik基因的识别也至关重要。因本研究未鉴定到调控AvrPik-A表达的转录因子，猜测其表达调控可能在转录后水平进行。另两个转录因子MGG_06788和MGG_09780敲除后，稻瘟菌丧失了对水稻抗稻瘟基因Pi3、Pi4b和Piz的识别。在接种这些单基因材料时，稻瘟菌由无毒变成有毒，表明这两个转录因子可能分别控制Pi3、Pi4b和Piz对应的无毒基因表达。鉴于这些无毒基因还未克隆，该研究有望开创一个新的无毒基因克隆方法。另两个转录因子MOEITF1和MOEITF2特异控制稻瘟菌的致病力，而对营养生长、产孢和附着胞发育没有影响。而且，这种特异控制致病力的机制是通过分别控制两个重要致病效应蛋白T1REP和T2REP的表达实现的。结合实验也证明，MOEITF1和MOEITF2可以分别结合T1REP和T2REP的启动子区。这些结果深入解析了稻瘟菌转录因子是如何通过调控效应蛋白（含无毒基因编码的蛋白）表达而实现对病菌致病力的控制。未来通过设计和开发靶向这些转录因子的生物农药，有望在转录水平干扰稻瘟病菌的致病力，为稻瘟病的防治提供新思路。