稻瘟病菌无毒基因 AvrPit 的克隆及其功能研究

Magnaporthe oryzae, which is a model fungal pathogen causing rice blast disease that is one of the most devastating diseases afflicting the rice production. Molecular characterization of avirulence gene is pre-required for better understanding molecular mechanisms underlying race specificity against rice cultivars. In the previous research, we have constructed a high-resolution genetic and physical map of AvrPit, which is responsible to the resistance gene Pit, thereby laying a solid base for map-based cloning of the target gene. In this proposal project, candidates in the target region will be differentiated by both PCR-based re-sequencing and allele-specific marker-based genotyping. Then, the candidate genes will be ascertained through genetic transformation, as well as the functional nucleotide polymorphism (FNP)-directed mutation assays. The population structure and evolutionary process of the target gene will be characterized by FNP-based genotyping in combination with phenotyping of over 300 isolates selected from various pathogen populations. The interactome of the target gene will be established by various protein interaction approaches. Then, the relationships between specific interactions and their functionalities will be established by various protein expression approaches. Furthermore, the key genes in the interactome will be functionally characterized by both gene-knock-down and gene-over-expression approaches. Taken together, the interactome and working model for AvrPit will be established in the project proposed.

稻瘟病菌既是农作物重要的病原真菌，又是分子微生物学研究的模式丝状菌。分离、克隆控制其小种特异性的无毒基因将有助于更加深入地了解该菌致病性及变异性的分子机制。在前期的研究中，申请人已经构建了无毒基因 AvrPit 高解析度的遗传及电子物理图谱。在本申请项目中，申请人将利用基于PCR产物的重测序以及等位基因特异性分子标记技术，对目标区域的候选基因进行鉴别分析；利用常规技术，对候选基因进行克隆及遗传转化，以确定目的基因；利用目的基因的功能性标记进行群体结构及其进化，以及突变体功能分析，以进一步阐明其生物学功能；利用蛋白质互作及功能表达技术，构建目的基因的互作网络及其与功能的关系；利用基因减量及超量表达技术，对互作网络的关键基因进行功能分析，以进一步确认互作与功能的关系。综合上述结果，确立目的基因的互作及工作模式。

稻瘟病菌属是农作物最重要的病原真菌之一，可侵染50余种禾本科植物；克隆并分析控制其品种/物种特异性的无毒基因将有助于了解其致病性以及寄主跳跃/扩展的分子机制。本团队在完成项目主要研究内容的基础上，为了冲击顶级科研成果，致力于如下3个研究方向的扩展及深入。1、AvrPit及Pit的群体结构及进化途径：在完成AvrPit的全球分化分布及其进化途径分析的基础上，为了进一步把握AvrPit及其对应的抗病基因 (Pit) 在中国稻作区的动态变化规律，对南北稻作区6个代表群体，以及黑龙江省10年间、广东省18个季节等大尺度时空群体进行了分析，阐明了南北稻作区生理小种及抗性的群体结构及其动态变化规律。2、AvrPit及Pit的鉴别及挖掘：在完成AvrPit的克隆及其功能研究的基础上，进一步开发了“一种在不同植物病害系统中通过病原物的接种即可鉴定抗病基因的技术体系”，以及“一组二套具包容性且精准鉴别挖掘并克隆稻瘟病Pit及 Pi54 抗病基因家族的技术体系”，由此提高了AvrPit及Pit的应用性。3、以AvrPit为抓手，构建麦瘟病菌完整的进化途径：麦瘟病由南美到南亚再到非洲，已经成为全球粮食安全的现实性威胁，但其病原菌的来源尚不清楚。本团队在上述研究中偶然发现麦瘟病菌的AvrPit绝大多数来源于稻瘟病菌。进一步对目前所有18个已经克隆的无毒基因进行了全球分化分布及其进化途径分析，阐明了其进化模式。为了构建麦瘟病菌完整的进化途径，遴选由稻瘟菌而麦瘟菌【Os to Ta(Os)】的 AvrPit，以及由杂草瘟菌而麦瘟菌【Po to Ta(Po)】的 AvrPix进行了系统、深入的研究。在AvrPit方面：基于2个种间特异性SNP的正反向突变是其由稻瘟菌寄主跳跃于麦瘟菌的关键；二者的作用途径不同，C55*G为下位性且差异性表达与湿度等相关；C77*G为上位性但与环境因子无关。在AvrPix方面：基于3个种间特异性SNP的温度适应性表达，以及上下游TE聚集而互为正负调控的差异性表达，是其由杂草瘟菌寄主跳跃于麦瘟菌的关键。确认并完善二者适应性表达的证据链是本项目冲击顶级科研成果的关键。