药用植物中异黄酮类成分抗缺血性脑卒中的活性筛选及作用机制研究

Medicinal plants have a series advantages including comprehensive regulation, multi target and little adverse effects, and have attracted more and more attention. The circulating ultrasound assisted extraction coupled with high speed countercurrent chromatography, high performance centrifugal partition chromatography and high performance liquid chromatography (CUAE–HSCCC–HPCPC–HPLC) will be established in this project to extraction and online isolation and analyses of the isoflavones and isoflavonoids for the medicinal plants of Trifolium prateose L., Trifolium repens L., soyabean, Belamcanda chinensis L., Pueraria lobata and flower of lobed kudzuvine. Oxygen/glucose deprivation (OGD) injured PC12 cells model was employed to screening and validation of efficacy of active ingredients of anti–cerebral arterial thrombosis activity. The mass spectrometry, nuclear magnetic resonance and other techniques were employed to analysis the potential active compounds. Molecular biology techniques were employed to detect the expression of associated proteins from PI3K/Akt signaling pathway and t Nrf2/ARE signaling pathway. On the basis of previous work, middle cerebral artery (MCAO) was established in mice was used to verify the activity of anti–cerebral arterial thrombosis, and neuroprotective effects and mechanism of PI3K/Akt signaling pathway and Nrf2/ARE signaling pathway were studied. On the basis of the study, a universial methods for anti–cerebral arterial thrombosis screening by medicinal plants were established, and provide a new thrombosis of activity evaluation and mechanism of the active compounds from the medicianl plants for the treatment of Cerebral arterial.

药用植物具有综合调节，靶点多和毒副作用小等优势，从药用植物中筛选抗缺血性脑卒中的药物具有重要的意义。本项目拟构建“循环超声波提取–高速逆流色谱–离心分配色谱–高效液相色谱联用技术”，对药用植物红车轴草、白车轴草、大豆、射干、葛根和葛花中异黄酮进行分离提取。采用糖氧剥夺离体脑缺血模型对分离得到的组分或单体化合物进行抗缺血性脑卒中活性评价。针对活性成分，应用电喷雾质谱等技术对单体化合物进行结构鉴定。采用分子生物学技术考察活性组分及单体化合物参与PI3K/Akt信号通路及Nrf2/ARE信号通路相关蛋白表达水平的变化，揭示异黄酮类物质抗缺血性脑卒中的作用机理。采用整体动物模型对其活性进行验证，并进一步阐明其参与PI3K/Akt信号通路及Nrf2/ARE信号通路抗缺血性脑卒中的机制。根据上述研究，建立一个药用植物抗缺血性脑卒中活性评价的普适性方法，为药用植物活性成分的筛选和机制研究提供新的思路。

本项目通过四年的研究工作，已充分地完成项目计划内容。完成内容与项目申报书及任务书内容一致。在天然产物的分离提取方面，利用液质联用技术鉴定了32个化合物。以乳酸脱氢酶为靶蛋白，利用受体配体亲和超滤技术从药用植物红车轴、白车轴、大豆、射干、葛根和葛花中筛选得到24个活性成分，建立了循环超声波提取–高速逆流色谱–离心分配色谱–高效液相色谱联用技术，利用该技术分离制备得到24个化学成分。此外，在项目的执行期内构建了动态超声波提取和离心分配色谱及高速逆流色谱等联用技术，对桑黄，桦褐孔菌，黑果枸杞中化学成分进行了分离提取，共分离得到18个化学成分。利用Aβ25-35诱导PC12细胞建立模型，用MTT法初步筛选出具有抗缺血性脑卒中的活性组分及单体化合物。利用分光光度法和荧光分度法检测PC12细胞的LDH释放，细胞内Ca2+浓度，ROS浓度和Caspase-3活性变化；用流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率；western blot检测Bcl-2，Bax，Caspase-3，p-AKT、AKT蛋白表达变化。通过以上指标从细胞水平揭示药物抗缺血性脑卒中的机理。应用缺血性脑卒中动物模型，通过动物实验评价大豆异黄酮、葛根异黄酮、葛花异黄酮、鸢尾苷、染料木素的抗缺血性脑卒中作用。对经PC12 细胞筛选出的有效组分及单体进行动物试验研究。通过超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px)、过氧化氢酶( CAT)活性和丙二醛( MDA)含量以及增加Nrf2、HO-1的表达等检测提取物和单体化合物对缺血性脑卒中动物的作用机理。项目执行期内，共发表科技论文31篇，其中国际SCI收录23篇；发表国际会议论文3篇；申请发明专利7项，授权实用新型专利2项；培养博士研究生1名，硕士研究生6名；获奖励2项，其中吉林省科技进步一等奖1项。