多孔菌科真菌抗Tau蛋白病变活性成分筛选及作用机制研究

The Tau protein pathology are closely related to Alzheimer's disease and vascular dementia. This project is based on previous work, with the pressurized liquid extraction, high speed countercurrent chromatography and related technologies were employed to the extraction and preparation of the anti-Tau protein pathology components from the fungus of Ganoderma lucidum, Phellinus igniarius, Inonotus obliquus and Poria cocos. The bio-active ingredients with anti-Tau protein pathology and dementia diseases was selected as a target. The protective mechanism of active ingredients on model cells and the protective mechanism against abnormally hyperphosphorylated Tau protein were investigated from the cellular level. Neuroprotective effects and mechanisms of the active compounds were examined on the dementia level from the animal level. iTRAQ/TMT high-throughput proteomics was employed to analysis of changes in protein phosphorylation profiles in PC12 cells before and after drug treatment. Identified important biomarkers which closely related to the disease and elucidated the mechanism of anti-Tau proteinopathies in Polyporaceae fungi by analyzing, identifying and verifying specific proteins with abnormal phosphorylation levels.

Tau蛋白病变与阿尔茨海默病和血管性痴呆等痴呆性疾病密切相关。本项目在前期研究工作基础上，采用加压液体萃取和逆流色谱联用等技术，对具有抗Tau蛋白病变作用的多孔菌科真菌灵芝、桑黄、桦褐孔菌、茯苓中化学成分进行快速制备，以具有抗Tau蛋白病变及痴呆性疾病的活性成分为研究对象，从细胞水平考察活性成分对模型细胞的保护机制以及对异常过度磷酸化Tau蛋白的保护机制；从动物水平考察活性化合物对痴呆小鼠模型的神经保护作用及机制；同时采用iTRAQ/TMT高通量蛋白质组学分析药物作用前后PC12细胞中蛋白质磷酸化谱的变化，通过分析、鉴定并验证磷酸化水平异常的特异性蛋白，明确与疾病发生密切相关的重要生物标志物，阐明多孔菌科真菌抗Tau蛋白病变的作用机制。

经过4年的研究，超额完成了研究目标，在化合物的结构分析及分离提取方面，利用液质联用技术鉴定了66个化合物。以乙酰胆碱酯酶为靶蛋白，利用受体配体亲和超滤技术结合PC12细胞模型共筛选得到12个活性成分，包括桑色素、灵芝酸A、灵芝酸B、无羁萜、啤酒甾醇、原儿茶醛、ergosta-7,22-dien-3-one、茯苓酸、齿孔酸、Inotilone、灵芝酸D2、灵芝酸C2，建立了超声波辅助离心提取–提取物在线浓缩–高速逆流色谱联用技术等技术，利用该系列技术将12个活性成分进行了制备。在化合物的活性评价和机制研究方面，建立冈田酸损伤的PC12细胞模型，用于快速、准确、高通量的筛选天然药物中抗阿尔茨海默病活性的有效成分，利用该方法确定的12个单体化合物，结合动物实验进一步验证与评价，确定了候选化合物的活性，从中筛选及确认了4个具有抗阿尔茨海默病活性成分，即灵芝酸A、桑色素、灵芝酸B和啤酒甾醇。利用PC12细胞筛选体系，检测PC12细胞的LDH释放量，细胞内Ca2+浓度，ROS浓度和Caspase-3活性变化；用流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率；western blot检测Bcl-2，Bax，Caspase-3，p-AKT、AKT等蛋白表达变化，开展天然产物的化学有效成分作用机制研究。利用模型动物考察活性单体的抗阿尔茨海默病效果。在此基础上，分析模型动物及药物治疗动物凋亡相关蛋白的表达水平，从蛋白水平分析药物作用机制。共发表学术论文44篇，含SCI收录论文28篇，论文全部标注资助；参加国际学术会议1次、进行国际会议报告1次、发表国际会议论文3篇；获得科研奖励2项；授权发明专利4项、授权实用新型专利6项、申请发明专利4项；培养硕士研究生9名；此外，由吉林省卫生健康委员会备案14个企业标准，研制、生产并销售了3种桑黄及茯苓相关的膳食补充剂。