人参属植物抗阿尔茨海默病的活性成分筛选方法及作用机制研究

As a common disease, Alzheimer's disease threatened people's physial and mental health and even their lives seriesly in nowadays. However, the synthesis drgus for anti-Alzheimer's disease showd various limitions. So it is significant to undertake the research and develop natural anti-Alzheimer's disease drugs. Base on the previous work, accelerated solvent extraction coupled with high speed counter current chromatography and related technologies were established to extraction and isolation of anti-Alzheimer's disease componds from natural plants of Panax ginseng, P. quinquefolius, P. notoginseng, P. pseudoginseng, P. japonicus C. A. Mey. var. major (Burk) and P.japonicus C. A. Mey. var. bipinnatifidus (Seem.), establish a fast separation and isolation methods for saponins. On the basis above mentioned, a fast active evaluation system for anti-Alzheimer's disease established. To study the mechanisms of apoptosis and neuroprotection of anti-Alzheimer's disease (AD) actions of components and monomers in vitro and animal model of Alzheimer's disease, PC12 cell induced by Aβ25-35 and AD rat model were taken out. In order to find the key protein, 2D DIGE and mass spectrometry are used for proteomic analysis of differences in model cells which are treated and untreated by the efficient components. The results will illustrate the anti-Alzheimer's disease mechanism of Panax plants form cell, animal and protein level, and would be helpful to explore the etiology and etiopathogenesis of anti-Alzheimer's disease.

阿尔茨海默病已成为现代社会的常见病，严重地威胁着人们的身心健康，然而合成抗阿尔茨海默病药物在治疗上有一定的局限性，因此从传统中药中开发研究抗阿尔茨海默病药物具有重要的理论意义和实际应用价值。本项目在前期研究工作的基础上，采用快速溶剂萃取和逆流色谱联用等技术，对具有抗阿尔茨海默病作用的人参属植物人参、西洋参、三七、竹节参、珠子参和羽叶三七中化学成分进行分离提取，构建皂苷类成分的快速分离提取方法，在此基础上，建立天然产物抗阿尔茨海默病的快速筛选方法。同时，以具有抗阿尔茨海默病活性的组分为研究对象，从细胞水平考察药物对Aβ致PC12细胞凋亡的保护作用及机制；从动物水平考察药物对阿尔茨海默病小鼠痴呆模型的神经保护作用及机制；采用荧光差异凝胶电泳和质谱等技术分析药物作用前后阿尔茨海默病细胞模型蛋白质水平的变化，发现与阿尔茨海默病相关的特异蛋白，进而全面阐明人参属植物抗阿尔茨海默病的作用机制。

本项目通过四年的研究工作，已充分地完成项目计划内容。完成内容与项目申报书及任务书内容一致。在天然产物的分离提取方面，利用二阶段高速逆流色谱技术分离提取竹节参和珠子参中化学成分，建立了三阶段加压液体萃取和高速逆流色谱联用技术，对人参、三七和西洋参中化学成分进行了分离提取。累计从药用植物中分离提取到28个化学成分。建立了加压液体萃取、高速逆流色谱、高效液相色谱联用技术，对人参叶和羽叶三七中化学成分进行分离提取和酶抑制评价。此外，在项目的执行期内构建了动态超声波提取和离心分配色谱及高速逆流色谱等联用技术，对白芍，钩藤，川芎中化学成分进行了分离提取，共分离得到14个化学成分。利用Aβ25-35诱导PC12细胞建立模型，用MTT法初步筛选出具有抗阿尔茨海默病的活性组分及单体化合物。利用分光光度法和荧光分度法检测PC12细胞的LDH释放，细胞内Ca2+浓度，ROS浓度和Caspase-3活性变化；用流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率；western blot检测Bcl-2，Bax，Caspase-3，p-AKT、AKT蛋白表达变化。通过以上指标从细胞水平揭示药物抗阿尔茨海默病的机理。应用阿尔茨海默病动物模型，通过动物行为实验评价人参、西洋参、三七、珠子参及竹节参皂苷抗阿尔茨海默病作用。此外，对经PC12 细胞筛选出的有效组分及单体进行动物试验研究。检测药物对Aβ25-35致阿尔茨海默病大鼠损伤的凋亡相关蛋白表达水平的影响，从基因水平分析药物作用机理。利用液质联用技术研究模型动物及给药模型动物脑组织内多巴胺、5-羟色胺及其代谢产物的含量，从化学角度分析药物作用机理。项目执行期内，共发表科技论文53篇，其中国际SCI收录38篇。国际会议论文2篇，申请发明专利3项，授权实用新型专利5项。培养博士研究生4名，硕士研究生9名。出版学术著作1部。获奖励4项，其中吉林省科技进步二等奖两项。