利用肝素化修饰天然脱细胞化材料促进工程化肝组织内血管网快速建立并长期维持肝细胞功能的机制研究

Liver diseases threaten human health severely. In recent years, significant advances have been made in the field of engineering liver tissue (ELT) construction based on the strategy of whole organ decellularization scaffolds - recellularization. However, the lack of effective vascularization strategy for ELT is the major obstacle to the clinical application. Our preliminary studies have proved that heparinization could increase the angiogenic capacity of decellularized liver scaffolds (DLS). Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are considered to be the most promising cell sources for clinical applications. In this research, we will utilize the iPSCs spheroids and DLS to fabricate engineering liver tissue and investigate the effects and mechanisms of heparinization on vascularization of engineering liver tissue, to establish an economic, easy and rapid vascularization strategy for ELT. Further exploration on the growth, differentiation, function, and proliferation of iPSC-derived hepatocyte-like cells in vivo after rapid vascularization and effectiveness evaluation of iPSC as an TEL cell source on the formation of ectopic functional liver tissue and the treatment of liver injury will be performed. The achievements will provide a new idea for the vascularization of ELT and other organs, as well as experimental evidence and strong support for its application in clinical transformation.

肝脏疾病严重危害人类健康。近年来，基于全器官脱细胞化支架-再细胞化策略在工程化肝组织（ELT）体外构建领域取得了显著进展。然而，缺乏有效的血管化策略是制约ELT临床应用的关键因素。在前期研究中本课题组证明了肝素化修饰可以提高肝脏脱细胞化支架（DLS）的血管生成能力。鉴于诱导性多能干细胞（iPSC）被认为是最具临床应用前景的种子细胞，本项目拟用iPSC聚球体联合DLS构建植入式ELT，研究肝素化修饰对ELT体内血管化进程的影响并对其作用机制进行深入探讨，以期获得一种经济、便捷及快速的血管化策略。同时，系统研究ELT在实现快速血管化后，iPSC源性肝样细胞在体内环境下的生长、分化、功能以及增殖能力，评估iPSC作为ELT种子细胞在体内形成异位功能性肝组织及其治疗肝损伤的有效性。本研究可能为组织工程肝组织及其他组织器官的血管化提供一条全新的思路，并为其在临床转化中的应用提供科学依据和有力支撑。

工程化肝器官发生目前还不是一种可行的治疗选择，但异位肝组织发生却是可能的。越来越多的证据表明，无论是体外还是体内，细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用在调控工程化肝组织的特性方面皆发挥着重要作用。在本研究中，我们首先利用大鼠肝细胞球体对肝素化去细胞化支架（DLS）进行再细胞化，以构建工程化肝组织。将工程化肝组织异位植入四氯化碳（CCl4）诱导肝损伤大鼠模型的大网膜。结果表明，肝素化DLS中的肝细胞球体在体内至少存活 10 周。整个支架充满肝细胞并排列良好。肝素化DLS组的体积扩大了400多倍。白蛋白合成、糖原储存和细胞色素P3A4活性等肝脏特异性功能在肝组织中高度表达。此外，如CD31染色所示，内皮细胞被募集，新血管形成，如异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖活体共聚焦显微镜所示。肝素化生物工程肝组织通过调节细胞外基质的沉积和降解减轻CCl4诱导的肝损伤。在此基础上，我们利用肝素化肝脏去细胞支架和干细胞球体来制造工程化肝组织，随后将其植入到正常大鼠和肝损伤大鼠的网膜中。评估植入的肝细胞样细胞在该异位肝脏系统中的存活率、肝脏特异性功能、分化水平和再生潜力，以及工程化肝组织的血管化状态和治疗潜力。我们证实了这些肝移植物在这个异位肝脏系统中可以存活并拥有肝细胞的特定功能，并可以有效地与宿主血管网络吻合。植入后4周，我们发现在肝脏受损的免疫功能正常的大鼠中，移植物中的肝细胞样细胞扩增超过9倍。免疫染色显示这些肝细胞样细胞可以在体内自组织成条索状结构。此外，这些肝移植物在CCl4诱导的肝损伤中表现出治疗潜力。据我们所知，这是第一份证明基于脱细胞肝脏支架和干细胞在异位部位形成可长期存活并实现血管化肝实质组织的报告。这些结果为工程化肝组织从构建到移植提供了一种经济可行的方法。该方法具有一定潜力用于临床医学，特别是代谢性肝脏疾病。