插入序列共同区在耐药基因捕获中作用机制的研究

我们前期研究发现多重耐药革兰阴性杆菌中整合子及转座子与多种耐药基因密切相关，但仍不能解释耐药基因亚型变种快速增长的原因。国外文献报道插入序列共同区（Insertion Sequence Common Region, ISCR）参与细菌耐药基因的滚环复制，且与1类整合子存在相关性，但ISCR元件参与耐药基因捕获的理论尚处于假说阶段，且该元件复制的调控机制也不明了。本研究试图明确上海地区多重耐药革兰阴性杆菌ISCR元件携带情况；利用反向PCR、基因上下游引物交叉扩增及southern杂交方法探讨整合子、转座子、ISCR元件与耐药基因的关系；基因定点突变及重组基因的克隆及表达技术探讨∏蛋白、ori复制起始位点、RepA蛋白在ISCR元件复制起始中的作用及调控机制。本项目旨在阐明ISCR元件参与的滚环复制在耐药基因播散中所起的作用，为控制耐药基因的播散和发现新的药物靶位提供理论依据。

耐药细菌的出现和传播，给临床抗感染治疗和医院感染控制带来了难题。虽然转座子和整合子这些系统可以解释大部分DNA分子间耐药基因的转移，但却不能解释传播的实质和耐药基因变种增长的原因。细菌的共同区参与了基因捕获，与1类整合子存在相关性，但ISCR元件参与耐药基因捕获的理论尚处于假说阶段。本研究试图明确上海地区多重耐药革兰阴性杆菌ISCR元件携带情况及其与耐药基因的关系；ISCR元件参与的滚环复制在耐药基因播散中所起的作用。本项目的研究内容主要包括以下几个方面：1、多重耐药革兰阴性杆菌耐药表型、基因型筛查及分子流行病学调查。2、耐药基因与整合子、转座子、ISCR元件关系的研究：筛查整合子的携带情况，并探讨其与各种耐药基因的关系。3、ISCR元件在耐药基因复制及转座中作用机制的研究：ISCR元件基因测序及分析。研究结果显示：共收集250株多重耐药革兰阴性杆菌，其中全耐药鲍曼不动杆菌90株，耐亚胺培南铜绿假单胞菌82株，多重耐药肠杆菌科细菌78株。纸片扩散法及琼脂稀释法对多重耐药革兰阴性杆菌进行耐药表型确证。实验结果显示，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性相对肠杆菌科细菌强，但肠杆菌科细菌中也不乏对亚胺培南耐药的菌株。在本组收集的多重耐药革兰阴性菌中，AmpC、TEM、SHV、CTXM-14型-内酰胺酶的产生占主导地位。鲍曼不动杆菌产生的-内酰胺酶以TEM型酶为主，而铜绿假单胞菌则以AmpC及OXA型酶为主，肠杆菌科细菌对亚胺培南耐药的机制是产生KPC-2型-内酰胺酶。在对丁胺卡那和庆大霉素同时耐药的菌株中，16S rRNA甲基化酶基因的携带率高达95%以上，以ArmA和RmtB为主要流行型别，且后者分离率较高，酶基因阳性株呈水平传播与克隆传播状态。该甲基化酶可导致氨基糖苷类高水平耐药，而且酶编码基因位于质粒上，具有转移性。-内酰胺酶基因和氟喹诺酮耐药决定因子可随之一同转移。250株多重耐药革兰阴性菌PFGE分析显示，各种属细菌亲缘关系不高，存在个别耐药菌克隆播散的情况。ISCR基因检测及分析结果显示，鲍曼不动杆菌携带率为0%，铜绿假单胞菌携带率为30.6%，肠杆菌科细菌携带率为30%。ISCR元件与1类整合子存在密切相关性。本研究结果为明确耐药基因播散机制及控制其播散和发现新的药物靶位奠定了一定的理论基础。