基于CRISPR靶向的染色质双模式成像

The spatiotemporal organization of chromatin structure plays a critical role in regulating biological processes in living cells. Imaging chromatin dynamics is crucial to understand intracellular processes. Recently, the RNA-guidable feature of CRISPR-Cas9 has been utilized for imaging of chromatin within live cells, using the fluorescently labelled dCas9 or sgRNA. However, these methods are mostly applicable to image highly repetitive regions in a short term, whereas imaging regions with low or no repeats remains in a long term as a challenge, due to the low fluorescent intensity and photo bleaching of the fluorophores and fluorescent proteins employed...To address this challenge, we propose to design fluorescent-plamonic probes specifically targeting single-guide RNAs (sgRNAs) to enable robust and long-term fluorescent-plasmonic dual-modal imaging of chromatin. We aim to achieve tracking of native chromatin loci throughout the cell cycle and determine differential positioning of transcriptionally active and inactive regions in the nucleus. We will also investigate the spatiotemporal organization of chromatin loci in cells with the treatment of CRISPR-Cas9 gene editing, Doxorubicin and RNA interference. Based on the present research project, we hope to provide a new imaging approach to monitor the position and dynamics of both repetitive and non-repetitive genomic regions of chromatin in live cells. We hope this study can serve as an important step towards directly visualizing dynamics of chromatin during modification processes and thus better understanding the correlation of chromatin organization and diseases.

本项目隶属于重点资助方向“生物大分子动态修饰的化学标记与检测技术”，研究重点为“针对生物大分子新型动态修饰，发展精准标记、检测和鉴定的新技术、新方法”。本项目针对染色质动态修饰，拟基于CRISPR靶向技术发展具有长时程观测能力的CRISPR-荧光等离子体双模式探针，建立基于单细胞双模式成像视角的染色质动态修饰的长时间连续监测方法，观察特定目标基因位点在正常细胞和肿瘤细胞内的时空分布特征，探索CRSPR基因编辑、阿霉素、RNA干扰等抗肿瘤治疗手段对细胞染色质中特定目标基因位点时空分布的影响。本项目有望实现对染色质动态修饰的高灵敏长时程动态检测，为揭示个体细胞内特定基因位点在染色质中的时空分布规律提供新方法，同时为其它生物大分子动态修饰过程的时空动态检测提供有益参考，推动纳米材料成像技术在生命化学分析和临床医学领域的应用。

本项目旨在利用CRISPR靶向技术，为染色体成像开发新工具和新方法。项目自执行以来，进展顺利，主要在单颗粒活细胞成像和CRISPR分子机器行为调控两个方面取得重要成果, 发表SCI论文10篇，包括Nature Protocols 1篇，Angewandte Chemie International Edition 2篇。参与培养博士后1人，博士研究生5人，项目负责人获得国家自然科学基金优秀青年项目资助。..本项目在单颗粒活细胞成像方面的代表性研究成果包括：1. 开发了一种基于比色法的算法，实现了金纳米粒子胞内聚集状态的自动、快速、定量的准确分析。该算法可以在200秒内有效区分20个单细胞中金纳米粒子（数目通常超过1000个）的聚集状态，同时适用于其它具有显著等离激元耦合效应的纳米粒子，在单细胞纳米等离子体定量分析中显示出良好的应用潜力。2.利用DNA四面体框架调节核酸i-motif二聚体结构的空间折叠，开发了一系列pH荧光纳米探针（响应范围pH 5.0-8.0），实现了活细胞内微小pH变化（0.2-0.4 pH单位）的高灵敏成像检测。本项目在CRISPR分子机器行为调控方面的代表性研究成果包括：1. 发展了一种基于DNA链取代反应的可编程快速激活CRISPR-dCas9靶标识别功能的新方法，实现了活细胞染色体的可控成像。与已有的光控、化学小分子激活等方法相比，该方法可以在一个sgRNA上直接构建多输入响应电路，并且基于DNA序列的正交性可以构建灵活多样的激活电路。2. 开发了一种基于 DNA 折纸的CRISPR-Cas9分子机器的单分子可视化研究平台。CRISPR-Cas9机器能够在平台上的特定位点以纳米级精度被可控激活，之后执行自由搜索和局部搜索两种模式并切割目标。以上体系可以拓展至Cas12a、Cas13a等其它CRISPR体系中，为扩展CRISPR分子机器的功能与应用提供了新策略。