基于TALE和CRISPR的活细胞染色质DNA荧光标记技术研究

The dynamic changes of gene location plays important roles in regulation of eukaryotic gene expression. Hence, fluorescent labeling and observation of a genomic locus in the live cell is highly valuable. The conventional FISH method is incompatible with the live cell, while the LacO labeling method is notoriously tedious and low-throughput, largely limiting its application. The emergence of artificial endonucleases, TALE and CRISPR, open a new door for the labeling of chromatin DNA in the live cell. However, the new methods still face a number of challenges, which prevent them from being used to label multiple non-repeating sequences with multi-colors. In this proposal, we aim at developing both new labeling and imaging methods, which will be readily used for multi-color labeling of single genomic loci with non-repeating sequences. Regarding new labeling methods, we will develop BiFC-based probes, which can simultaneously reduce the background fluorescence, off-target effects and the interference for transcription and replication due to labeling. This will also require much fewer kinds and number of probes, easing the labeling processes. We will also carry modification to the sgRNA, and combine them with the orthogonal CRISPR systems to realize multi-color, multi-loci imaging. Regarding the imaging methods, we will develop reflection-based light-sheet microscope that is dedicated to single molecule imaging in the nucleus. The new imaging method largely improves the signal-to-noise ratio as well as the temporal resolution, ensuring the application of the new labeling methods in the live cell. Accomplishment of this proposal will provide powerful tools for the study of the function and dynamics of chromatin DNA.

细胞生命活动中基因位点的动态变化是真核细胞基因表达调控的一个重要层面。因此，特异标记并观察活细胞基因位点十分重要。传统的FISH不兼容活细胞，而LacO标记则操作繁琐通量低，限制了其广泛应用。TALE和CRISPR的出现为活细胞染色质DNA的标记打开了一扇新的大门。但其目前面临多个问题，制约了对非重复序列及多基因位点的标记。本项目旨在创新和改进标记和成像方法，利用TALE和CRISPR实现活细胞非重复序列单基因位点的多色标记和成像。在标记方法上，建立基于BiFC的新方法，同时降低背景荧光、脱靶效应以及功能干扰，并减少所需探针种类降低实验繁琐程度。发展sgRNA修饰的方法并与正交CRISPR系统融合实现多色标记。在成像方法上，发展专用于单细胞动态成像的反射式层状光显微技术，大幅提信噪比和成像速度，为新标记方法的应用提供技术保证。本项目的完成将为染色质DNA相关动态过程和功能研究提供有力工具。

基因的空间位置是3D基因组的一个重要指标，也是真核细胞基因表达调控的一个重要层面，因此测量细胞内基因的空间位置及动态行为非常重要。为此亟需发展新方法，对活细胞内基因位点运动过程实现高效、可信、稳定的多色多点标记和观测。传统的FISH不兼容活细胞，而LacO标记则操作繁琐通量低，限制了其广泛应用。TALE和CRISPR的出现为活细胞染色质DNA的标记打开了一扇新的大门。但其目前面临多个问题，制约了对非重复序列及多基因位点的标记。本项目旨在创新和改进标记和成像方法，为染色质DNA相关动态过程和功能研究提供有力工具。.申请人在项目支持下取得了一系列创新成果，有代表性的工作包括：发明活细胞基因位点多色荧光标记技术，包括基于BiFC-TALE的活细胞染色质DNA的多色荧光标记技术，基于修饰sgRNA的活细胞染色质DNA的多色荧光标记技术，以及基于串联sgRNA和SunTag信号放大的基因位点标记方法，实现活细胞多个基因位点同时长时程连续观察，为研究3D基因组动态过程提供了重要工具；我们为以上技术申请了两个专利，同时分别于2017年和2018年受邀撰写了综述，总结和点评染色质结构和动态研究的技术和方法。同时，我们研发多个新型活细胞超分辨荧光探针。我们发展了新型光切换荧光蛋白GMars探针系列，性质优异，为细胞内精细结构的连续、长时间动态观察提供了重要的工具。该工作在ACS NANO以封面文章发表，同时获得荧光蛋白领域的著名专家的长文评述。另外，我们在国际上首次研发出光闪烁小型聚合物量子点，打开了聚合物量子点超分辨成像的新领域。该成果以封面文章发表在国际权威刊物Advanced Materials上，同时被所有审稿人评为VIP文章。.在本项目支持下，团队发表通讯作者文章17篇，在细胞成像技术研发及应用方面获得国际同行赞誉，多次受邀在Gordon Research Conference等国内外高水平专业会议做学术报告。项目在真核细胞染色质标记和动态成像方面的研究为系统研究各种表观遗传机制对染色质高级结构动态变化及相关的DNA 复制、损伤修复和基因调控的分子机制研究打下了坚实基础。