晚期致炎因子HMGB1在酒精性肝病中的作用及机制

酒精性肝病（ALD）发生的中心环节是酒精及其代谢产物和肠源性LPS激活肝脏固有性免疫系统，致炎症因子的过量产生。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是固有免疫应答过程中的关键触发因子和重要的晚期炎症因子。在前期研究发现ALD患者血清内HMGB1水平及ALD大鼠肝脏HMGB1表达明显上调的基础上，本课题拟观察以AAV介导HMGB1 boxA肠道表达拮抗HMGB1及主动免疫方式中和HMGB1对大鼠实验性ALD的抑制作用，证实HMGB1在ALD炎症发生过程中的作用；通过精密肝切片培养，从亚器官水平观察酒精和LPS诱导肝组织释放HMGB1的作用及HMGB1对炎症因子释放的促进作用；通过培养肝细胞、肝星状细胞和巨噬细胞，进一步从细胞水平确定ALD过程中HMGB1的来源及HMGB1在ALD中发挥作用的靶细胞，旨在验证HMGB1在ALD发生过程介导炎症的作用及初步阐明其作用机理，为ALD防治提供新的靶分子。

（1）以及因工程技术表达和纯化了HMGB1、HMGB1 A box、HMGB1 B box重组蛋白。（2）制备了针对多个HMGB1表位的小鼠多克隆抗体，可用于免疫组化、免疫荧光、Wstern blot及双抗体夹心ELISA法检测HMGB1的表达。（3）制备了4个基于乙型肝炎核心蛋白为载体，携带HMGB1表位的重组蛋白（HBcΔ-HMGB1-53-63、HBcΔ-HMGB1-67-78、HBcΔ-HMGB1-95-112、HBcΔ-HMGB1-150-183），证实了其免疫原性，作为候选HMGB1疫苗。（4）制备了能分泌表达HMGB1 A box的重组腺相关病毒(AAV-HMGB1 A box)。（5）以AAV-HMGB1 A box + C tail介导HMGB1 A box+C tail拮抗胞外型HMGB1可减轻小鼠ALD肝脏损害，降低转氨酶，减轻肝细胞坏死，改善脂肪变，降低血清甘油三酯。提示HMGB1在酒精性肝病发生发展中起着重要作用，AAV介导HMGB1 A Box+C tail分泌表达有望成为治疗ALD的新方法。（6）观察了HMGB1疫苗对CCl4诱导的实验性肝纤维化的抑制作用。发现以HBcΔ-HMGB1-95-112免疫对CCl4诱导的小鼠肝纤维化有显著的抑制作用，提示HMGB1参与了肝纤维化的发生发展，而且提示其有进一步研究价值和开发潜力。（7）证实经AAV介导的HMGB1 A Box分泌表达能够减少CCl4诱导的纤维化过程中肝细胞死亡、减轻肝细胞损伤，减轻肝纤维化程度。AAV介导HMGB1 A Box分泌表达有望成为一种简单、安全、有效的肝纤维化治疗新方法。（8）发现AAV-HMGB1 A box能显著抑制DSS和TNBS诱导的小鼠结肠黏膜损伤，抑制肠黏膜炎症细胞侵润，调节黏膜炎症因子水平，显著减轻肠黏膜细胞凋亡和黏膜上皮细胞增生。提示胞外HMGB1在炎症性肠病的发生、进展过程中起着关键作用，AAV-HMGB1 A box介导HMGB1 A box分泌表达拮抗HMGB1有可能成为炎症性肠病的治疗手段之一。（9）观察了HMGB1疫苗及AAV-HMGB1 A box对博莱霉素诱导的实验性肺纤维化的抑制作用。初步结果不支持HMGB1在BLM肺纤维化中的致病作用。（10）正在采用SELEX技术筛选针对HMGB1 B box的核酸适配子。