临床分离2型登革病毒及其EDI原核表达蛋白损伤血管内皮细胞凋亡机制和基因水平变化的研究

A large number of pre-work basis, plans to use from the clinical DHF patients with DEN-2 clinical separation and the international reference strains, and build the ED Ⅰ, domain of the Prokaryotic expression plasmid and protein expression, respectively, infection or role in the primary and transfer on behalf of people VEC, the system reseach of DEN led to the mechanism of apoptosis of the VECs; observe the laws of their cytokine production; cell permeability changes and ultrastructural changes; microarray experiments, data analysis, real-time qRT-PCR, and paired t-testscreening of differentially expressed genes, gene ontology analysis of the infected group and uninfected group (gene Ontology, GO); analysis of differentially expressed genes involved in the pathway analysis the VECs DEN infection levels of gene changes; by in vivo FITC-albumin permeability testalbumin may damage the blood-brain barrier into the brain parenchyma, to reflect the increased permeability of the blood-brain barrier of the fluorescence intensity in the detection of brain tissue. With FITC-albumin as a tracer to monitor the degree of damage of the blood-brain barrier to provide adequate scientific basis for the elucidation of the pathogenesis of DHF / DSS.

在大量前期工作基础上，计划利用来自临床DHF病人的DEN-2临床分离株和国际参考株，构建 EDⅠ结构域原核表达质粒和表达蛋白，分别感染或作用于原代和传代人VEC，系统地研究DEN导致VECs凋亡的机制；观察其细胞因子产生的规律；细胞通透性的改变和超微结构的变化；并通过基因芯片实验、数据分析、real-time qRT-PCR、配对t检验分析感染组与未感染组间筛选差异基因的基因本体(Gene Ontology，GO)；分析差异基因主要参与的通路，分析VECs被DEN感染后基因水平的变化；通过体内FITC-白蛋白通透性试验 白蛋白可通过损伤的血脑屏障进入脑实质，可通过检测脑组织中荧光强度来反映血脑屏障的的通透性增加。应用FITC-白蛋白为示踪剂, 监测血脑屏障的损伤程度，为DHF／DSS的发病机制的阐明提供充分的科学依据。

较好地完成了研究计划。包括原代HUVEC的分离、培养、传代和鉴定，DENV-2 毒株扩增鉴定、毒力检测和NS1基因部分序列原核蛋白的表达。完成DEN2感染对HUVEC自噬，凋亡及Fas/FasL表达水平的影响和诱导HUVEC经AIF相关的非caspase依赖途径凋亡的探索 。完成基于生理基底弹性硬度的体外HUVEC培养模型构建与鉴定，探索基底刚度对DENV-2感染人原代脐静脉内皮细胞和IFN L1R在DENV感染时对VECs生物学功能的影响，对DENV2感染hydrogel上培养HUVEC直接效应观察及基因表达谱差异和对细胞产生IL-29的影响进行研究，研究了DENV-2诱导原代人真皮微血管内皮细胞通透性变化机制和原代人肝窦内皮细胞凋亡，自噬及其相关基因表达的影响。结果证明巴伐洛霉素A1可抑制DEN2的增殖和DEN2感染HUVEC自噬的发生，DEN2感染HUVEC后，在胞浆内DEN2 NS1与自噬标记性蛋白LC3B、溶酶体标记蛋白LAMP1共定位。在DENV诱导的HUVEC凋亡中，Fas/FasL激活的凋亡死亡受体途径可能有一定的作用，同时存在caspase依赖和非caspase依赖两条途径，AIF可能参与了非caspase依赖的凋亡途径。基底刚度可影响人原代HUVEC的增殖效率，但并不影响细胞周期与细胞凋亡率的改变、细胞活力的下降。培养在25kPa弹性凝胶的PHUVEC，细胞的CX40、糖萼含量较高。DENV-Ⅱ时，细胞的大量死亡与PHUVEC大量分泌IFN-β密切相关，一旦IFN-β被中和后，PHUVEC感染和死亡水平明显上升。IL-29R在PHUVEC和C57BL/6小鼠VECs上均存在表达，受DENV感染后，可维持VECs屏障稳定性。HHSEC对DENV-2易感,被感染后LC3B及Beclin1的表达增高；感染早期可诱导HHSECs的细胞凋亡、自噬，并诱导ICAM-1上调，激活HHSECs。DENV-2能感染pHDMECs；pHDMECs通透性增加与凋亡及CXCL-11、ICAM-1无关，但与促炎性细胞因子IL-6和IL-8明显上调关系密切。本项目培养硕士生8名，博士生1人。发表研究论文6篇，其中SCI收录1篇，国内核心期刊6篇，待发表论文3篇。贵州医科大学免疫学团队获贵州省人才创新团队；以免疫学为牵头学科，贵州医科大学基础医学获贵州省特色重点学科。