细胞自噬在DENV-2感染HUVEC复制中的作用及其AMPK/ERK/mTOR信号通路的研究

The previous studies have shown that the passage HUVEC can be induced autophagy by DENV2, the DEN2 NS1 in the cytoplasm is colocalized with the autophagy marker protein LC3B and the lysosomal marker protein LAMP1, but the mechanism of signaling pathways is unknown.In this study, molecular biology, proteomics and Gene knockdown were used to observe the effects of DENV infection on autophagy of host cells. Using autophagy and its signal pathway inhibitor and stimulator, the dynamics of autophagy on virus replication, release and infection and its effect on host proliferation and function were detected. Through the deep research on the signal path of DENV2 infected HUVEC-induced autophagy AMPK/ERK/mTOR, the target point of DENV2 induced HUVEC apoptosis was found. To construct the target locus gene knockout HUVEC cell line and mice, verified the correlation between HUVEC dysfunction, virus proliferation and autophagy caused by DEVV-2 infection, and the characteristics of immune response in target locus gene knockout mice. The aim is to provide sufficient scientific basis for elucidating the pathogenesis and treatment of DENV infection, and to determine whether autophagy pathway and its signal pathway can become a new target for the treatment of DENV infection.

前期研究证明，DENV2可以诱导传代HUVEC发生自噬，在胞浆内DENV2 NS1与自噬标记性蛋白LC3B、溶酶体标记蛋白LAMP1共定位，但其信号通路机制不明。本研究拟利用分子生物学，蛋白组学、基因敲除等技术，通过①观察DENV感染HUVEC不同时期对宿主细胞自噬的影响；②使用自噬及其信号通路抑制剂、促进剂，检测自噬对病毒复制、释放及感染的动力学和对宿主增殖和功能的影响；③通过对DENV2感染HUVEC诱导自噬AMPK/ERK/mTOR信号通路进行深入研究，寻找DENV2诱导HUVEC凋亡的靶位点。④构建靶位点基因敲除HUVEC细胞系和小鼠，通过体内外实验，验证DENV-2感染后导致HUVEC功能障碍、病毒增殖与自噬的相关性,靶位点基因敲除小鼠免疫应答类型的特点?旨在为DENV感染发病机制的阐明和治疗提供充分的科学依据，明确自噬途径及其信号通路可否成为DENV感染治疗的新靶点。

通通过本研究培养博士研究生2人，硕士研究生4人。完成研究论文8篇，其中SCI 2篇，参加第17届国际免疫学大会（2019，北京）1篇，3篇国家级核心期刊，已投稿SCI 论文2篇。较好地完成了全部研究计划，申请结题。.包括原代HUVEC的分离、传代和鉴定，DENV-2 毒株扩增鉴定、毒力检测。.本项目还通过DENV-2诱导HUVEC自噬和影响细胞活力；DENV-2感染的HUVEC和Balb/c小鼠受CYM-5442干预后免疫机制的研究；DENV-2感染HUVEC诱导自噬AMPK/ERK/mTOR信号通路的研究；巨噬细胞迁移抑制因子通过调节AMPK/ERK/mTOR途径对DENV2诱导HUVEC自噬影响的研究；DENV-2非结构蛋白NS1和HUVEC TRIM22蛋白通过调控AMPK通路介导病毒诱导自噬的机制研究以及DENV-2感染HUVEC的磷酸化蛋白质组学分析六个方面的研究。研究结果证明DENV-2感染可抑制HUVEC的生长；而DENV-2诱导HUVEC产生的自噬却有利于HUVEC的存活。HUVECs被DENV2感染后与不同免疫细胞共培养，能促使Treg细胞对抑炎性细胞因子的分泌上调。建立被感染Balb/c小鼠模型，S1P1受体特异性激动剂CYM-5442的干预显著下调各种炎性细胞因子的表达，保护靶器官的损伤。提示受DENV感染后，HUVEC与免疫细胞之间可发挥相互的免疫调节作用；S1P1受体特异性激动剂对DENV感染造成的组织损伤具有一定的保护作用。DENV-2诱导HUVECs发生完整自噬反应：DENV-2感染可诱导HUVECs自噬体和自噬囊泡形成。ERK1/2-AMPK、ERK1/2-TSC2是相互作用的。DENV-2感染诱导HUVECs是通过激活ERK1/2(AMPK的下游)途径后抑制mTOR；TSC2是位于ERK1/2和AMPK下游参与DENV-2调节的自噬的研究。证实内源性MIF可正调节LC3-Ⅱ水平；抑制内源性MIF可下调AMPK/ERK/mTOR通路活性、自噬活性，提示DENV2感染HUVEC引起内源性MIF变化可通过调控AMPK/ERK/mTOR途径影响自噬水平。DENV-2感染HUVEC存在较多差异表达蛋白，p-JUN的下调、p-MAP2K2和p-AKT1的上调提示3个能够调节自噬的磷酸化蛋白可能与DENV-2感染机制有关。